[发明专利]一种治疗HIV感染的嵌合抗原受体的重组基因构建及其应用

说明书

本发明涉及感染性疾病免疫治疗技术领域，具体涉及一种治疗HIV感染的嵌合抗原受体(CAR)的重组基因构建及其应用。本发明提供了一种单链抗体ScFv，该单链抗体能够识别感染HIV病毒细胞表面的gp120，是通过串联针对感染HIV病毒细胞表面的gp120的抗体轻链、重链可变区而得到的；将该单链抗体制成嵌合型抗原受体(CAR)，将CAR编码基因转入质粒载体，并将转入了CAR编码基因的慢病毒载体转导到CD8⁺T淋巴细胞，所得的CAR‑T淋巴细胞在体外实验和体内实验中均发现具有显著的抑制、杀灭HIV感染细胞的活性，能够作为活性成份制备抗HIV感染的药物，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及感染性疾病免疫治疗技术领域，具体涉及一种治疗HIV感染的嵌合抗原受体的重组基因构建及其应用。

背景技术

艾滋病是由人类免疫缺陷病毒1型(Human Immunodeficiency Virus 1，HIV-1)感染引起的一种重大威胁人类生命安全的传染病，据世界卫生组织的最新统计,自发现到2014年底已造成3900多万人死亡，目前世界上艾滋病毒感染者仍有3700万。我国艾滋病毒感染者逐年增加，其总患病人数已突破百万。目前尚无有效疫苗且现有药物不能彻底治愈。

高效抗逆转录病毒治疗(HAART)是HIV/AIDS治疗史上的第一次革命，其极大的降低了HIV/AIDS的发病率和病死率，显著延长了患者寿命，甚至降低了HIV的传播。但也面临着很多挑战：1)患者必须终生服药，需付出昂贵的经济代价；2)严重的毒副作用；3)耐药毒株的出现；4)更为重要的是cART不能彻底清除病毒，主要是因为药物仅对复制中的病毒有效，而对HIV在感染早期建立的潜伏性病毒“储藏库”(reservoir)是无效的。一旦抗逆转录病毒治疗中断，病毒储藏库中的整合前病毒再度激活，几乎所有患者体内病毒血症会迅速反弹。

艾滋病毒在其传播和繁殖过程中的高变异性使得以往有效的艾滋病药物失效，因此出现了后来的“鸡尾酒疗法”，也就是联合多种抗病毒药物来进行高效抗逆转录病毒治疗，但是鸡尾酒疗法同样有着其局限性。综合目前国际上艾滋病研究的前沿和热点问题，研究者普遍认为HIV不能治愈的主要原因是HIV在感染极早期就在机体内建立起隐秘的病毒“储藏库”，即静息记忆的CD4+T淋巴细胞(Resting memory CD4+T)。

要找到治愈艾滋病的一个重大挑战，就是如何能够重新激活潜伏的HIV从而被机体的免疫系统自发识别和清除(shock and kill)。同时，研究发现，即使在接受cART治疗的感染者体内，也出现不可逆转的免疫损伤，特别是细胞毒性T细胞(CTL)的数量减少和功能缺陷,这表明通过抗逆转录病毒治疗重建的机体免疫系统将不能有效的清除那些被激活的细胞，需要通过联合增强机体HIV特异性免疫应答的方法来增强对HIV储藏库的清除效果。因此，对HIV潜伏性病毒“储藏库”的形成及激活策略和以重建机体免疫功能的探索都是迈向治愈HIV时代极有价值的研究方向。

近几年来，基于嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)肿瘤免疫治疗技术创造了杀伤肿瘤细胞的全新途径。由于其具有高亲和力和MHC(Majorhistocompatibility complex)非依赖性等优点，特别是由两个CD28及4-1BB、CD3ζ偶联形成的3代CAR可增强T细胞的杀瘤能力并延长了其在体内的存活时间，从而在白血病和淋巴瘤等肿瘤免疫治疗中取得了令人鼓舞的成效。其实早在1994年，Roberts等人尝试用CAR-T细胞治疗HIV感染，他们选取CD4序列作为单链抗体用于结合感染细胞表面的gp120，虽然具有部分杀感染细胞功能且经过多年的努力，但最终以失败而告终。其主要原因有以下几个方面：1.使用逆转录病毒载体转导效率较低，为了获得足够的可回输CAR-T细胞，过度的体外扩增导致回输后细胞死亡和CAR分子的丢失。2.CAR分子设计本身存在缺陷，其中CD4结构域可能引起转导的CTLs被HIV感染或者病毒感染细胞通过下调CD4分子的表达而逃脱CAR-T细胞的杀伤。

发明内容