[发明专利]一种检测肺癌相关基因热点突变的试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种检测肺癌相关基因热点突变的试剂盒及其应用。本发明保护引物对组(序列1至序列28)和记载有“检测待测者的肺癌相关基因是否发生突变的方法”的可读性载体在制备用于检测肺癌相关基因突变的试剂盒中的应用。本发明以血浆作为检测样本，并且针对肺癌相关基因(ALK基因、BRAF基因、EGFR基因和KRAS基因)设计14对特异性引物，再结合高通量测序的检测方法提高了检测数据量和实验结果准确性，可准确有效地监测肺癌相关基因的突变，该检测方法的灵敏度在0.05％。

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种检测肺癌相关基因热点突变的试剂盒及其应用。

背景技术

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。随着医学诊断技术特别是分子诊断技术的不断提高，针对肺癌的新的基因不断被发现，基于驱动基因的新型靶向药物不断涌现，肺癌精准治疗成为了关注的热点。

肺癌相关基因(ALK，BRAF，EGFR、KRAS和NRAS)的热点突变，有如下：ALK基因的热点突变，涉及1151Tins、L1152R、C1156Y、F1174La、L1196M、G1202R、S1206Y、G1269A等；BRAF基因的热点突变，V600E；EGFR基因的热点突变，涉及G719A、G719C、G719S、A763_Y764insFQEA、T790M、L858R等；KRAS基因的热点突变，涉及G12C、G12R、G12S、G12A、G12D、G12V、G13C、G13R、G13S、G13A、G13D、Q61K、Q61L、Q61R、Q61H等。

目前已报道的检测肺癌相关基因突变的方法有：

1)直接测序法。用PCR扩增产物进行测序和TA克隆并再次测序以最终确定突变的碱基位置。该方法比较繁琐、耗时长，而且由于自身的限制导致其灵敏度不高，只能对含量大于20％的基因突变进行检测。因此，此法不适合在临床中应用。

2)变性高效液相色谱法(DHPLC)。该方法对已知和未知的突变位点均可以检测，灵敏性在5％左右，但检测过程中需要打开反应管，容易造成污染，而且阳性结果不能确认具体位置，最终需要测序确认。

3)高分辨率溶解曲线(HRM)是基于核酸的物理性质，通过饱和染料结合于PCR扩增产物，监控产物溶解曲线的变化分析基因突变。检测敏感性在5％左右，对于阳性结果并不能确认具体位置，最终需要测序确认。

4)探针扩增组织突变法(ARMS)。利用引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计针对突变位点的特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物的3’碱基与模板配对时PCR扩增反应才能正常进行，从而检测出突变。通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入两种引物及3’端引物进行两个平行的PCR，结合有与突变DNA完全互补的引物才可以延伸并得到PCR扩增产物，该检测方法的灵敏度在1％左右。

5)等位基因特异的Taqman聚合酶链式反应(CAST-PCR)。该方法采用优化Taqman探针，通过一段特异设计的MGB探针来阻止引物与野生型DNA结合，选择性的优化扩增突变型DNA，该检测方法的灵敏度在1～0.1％左右。

这些技术的灵敏度都不高，检测的特异性差，不能满足对肺癌检测的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测肺癌相关基因热点突变的试剂盒及其应用。

首先，本发明要求保护引物对组和/或记载有“检测待测者的肺癌相关基因是否发生突变的方法”的可读性载体在制备用于检测肺癌相关基因突变的试剂盒中的应用；所述肺癌相关基因为ALK基因、BRAF基因、EGFR基因和KRAS基因。