[发明专利]一种高效籼稻遗传转化方法

权利要求书

1.一种高效籼稻遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：愈伤组织的诱导

选取成熟良好、完整的籼稻种子的米粒，先用75％的酒精消毒3分钟，再浸泡于25％(V/V)的次氯酸钠溶液，并置于150rpm、25℃的摇床上消毒20分钟；在超净工作台上，将上述消毒后的种子用无菌水洗涤4-5次，然后转移至无菌滤纸上吸干水分，再将适量的种子接种于NB培养基，在28-30℃下光照培养8-10天，诱导愈伤组织；

步骤2：愈伤组织的预培养

在步骤1所述愈伤组织中挑选结构致密、颜色鲜亮、颗粒状的愈伤组织转入预培养基中，于28-30℃下光照培养3天用于转化；

步骤3：农杆菌的培养及农杆菌介导的转化

将含有目的基因的植物表达载体通过电激转化法转入农杆菌菌株EHA105，选取阳性菌株划线于YEB抗性平板，28℃暗培养3天，再用接种针刮取米粒大小的农杆菌震荡悬浮于装有70ml农杆菌浸染液的150ml三角瓶中，并置于150rpm、28℃的摇床上摇10分钟，然后将步骤2所述光照培养3天的籼稻愈伤组织浸泡于上述农杆菌浸染液中，在150rpm、28℃的摇床上摇10分钟；

步骤4：农杆菌与愈伤组织的共培养

将步骤3所述浸染后的籼稻愈伤组织置于无菌滤纸上吹干，然后将所述愈伤组织转移到共培养基上，共培养基平板预先垫一张无菌滤纸，用1ml的农杆菌浸染液打湿，并除去气泡，28℃暗培养3天；

步骤5：抗性愈伤组织的筛选

将步骤4所述共培养3天后的愈伤组织置于250ml三角瓶中，用无菌水洗涤4-5次，直至洗涤液清澈透明为止；然后加入过滤灭菌的500mg/L的羧苄青霉素溶液洗涤所述愈伤组织，室温置于摇床150rpm震荡洗涤15min，再将所述愈伤组织置于无菌滤纸上吸干水分，接种于含有相应筛选剂的筛选培养基上筛选，所述筛选培养的条件为28℃、光照培养20-22天，中间继代一次，直到长出抗性愈伤组织；

步骤6：抗性愈伤组织的分化

将步骤5所述筛选后得到的抗性愈伤组织转入含有筛选剂的分化培养基上，于28℃、光照培养18-23天，中间继代一次，使其再生绿苗；

步骤7：再生苗的生根

将步骤6所述分化培养基上长出的幼苗转入含有筛选剂的生根培养基中，30℃、光照培养10-12天，获得再生苗；

步骤1中所述的NB培养基组分为：N₆无机盐和有机物+肌醇0.1g/L+谷氨酰胺0.5g/L+酸水解酪蛋白0.5g/L+脯氨酸2.878g/L+蔗糖30.0g/L+琼脂粉8.0g/L+2,4-D 2.0mg/L，pH为5.8；

步骤2中所述的预培养基组分为：N₆无机盐和有机物+肌醇0.1g/L+谷氨酰胺0.5g/L+酸水解酪蛋白0.5g/L+脯氨酸2.878g/L+蔗糖30.0g/L+琼脂粉8.0g/L+2,4-D 2.0mg/L+乙酰丁香酮0.1mM，pH为5.8；

步骤3中所述的农杆菌浸染液组分为：AA无机盐和有机物+肌醇0.1g/L+酸水解酪蛋白0.5g/L+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36.0g/L+谷氨酰胺0.9g/L+天冬酰胺0.3g/L+精氨酸0.176g/L，pH为5.2；使用前加入乙酰丁香酮0.1mM；

步骤4中所述的共培养基组分为：N₆无机盐和有机物+肌醇0.1g/L+酸水解酪蛋白0.3g/L+蔗糖30.0g/L+葡萄糖10.0g/L+琼脂粉8.0g/L+2,4-D 2.0mg/L，pH为5.2，灭菌后加入乙酰丁香酮0.1mM；

步骤5中所述的筛选培养基组分为：N₆无机盐和有机物+肌醇0.1g/L+酸水解酪蛋白0.5g/L+脯氨酸2.878g/L+谷氨酰胺0.3g/L+蔗糖30.0g/L+植物凝集素4.0g/L+2,4-D2.0mg/L，pH为5.8；灭菌后加入羧苄青霉素400mg/L+潮霉素30mg/L或Basta 4mg/L；

步骤6中所述的分化培养基组分为：MS无机盐和有机物+肌醇0.1g/L+酸水解酪蛋白2.0g/L+脯氨酸0.3g/L+蔗糖30.0g/L+山梨醇30g/L+植物凝集素4.0g/L+NAA 0.02mg/L+Kinetin2 mg/L，pH为5.8；灭菌后加入羧苄青霉素400mg/L+潮霉素30mg/L或Basta4 mg/L；

步骤7中所述的生根培养基组分为：MS无机盐和有机物+肌醇0.1g/L+酸水解酪蛋白2.0g/L+脯氨酸0.3g/L+蔗糖30.0g/L+植物凝集素4.0g/L，pH为5.8；灭菌后加入羧苄青霉素400mg/L。