[发明专利]一种高效籼稻遗传转化方法

说明书

本发明公开了一种高效籼稻遗传转化方法，该方法包括：籼稻成熟胚愈伤组织的诱导、愈伤组织预培养、农杆菌的培养及农杆菌介导的转化、农杆菌与愈伤组织的共培养、抗性愈伤组织的筛选、分化和再生苗的生根；该方法简便高效，所获得的愈伤组织质量好，适合转化，转化操作流程简便，通过对籼稻品种籼型两系不育系628S和籼型两系恢复系2537进行转化，发现60天左右即可获得籼稻阳性转化植株，转化效率高达35％以上，转化率较高，提高籼稻的遗传转化效率。

技术领域

本发明属于植物组织培养及转基因工程技术领域，具体而言，涉及一种高效籼稻遗传转化方法，本发明适用于诱导和继代籼稻成熟种子的愈伤组织，以及农杆菌介导的胚性愈伤组织的遗传转化方法。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是我国最重要的粮食作物之一，分为籼稻和粳稻两大亚种，其中籼稻是我国最大的栽培稻类型，栽培面积约占全国水稻面积的74％。利用转基因技术对水稻品种进行改良，培养高产、优质、多抗、广适的新品种在保障全球粮食安全的同时也是今后水稻育种的发展方向。因此，水稻的遗传转化，尤其是籼稻的遗传转化在品种改良、基因功能检测、创造突变体中发挥着越来越重要的作用，而建立高效、稳定的籼稻遗传转化体系是分子育种和功能基因组学等领域研究的前提。

近年来，水稻遗传转化技术取得了重要突破，并大部分在粳稻中建立了快速、高效、稳定的遗传转化体系。在此基础上，已经将许多重要性状如抗虫、抗病、抗逆、品质改良、发育调控、营养高效利用等外源基因转入水稻中。然而对于种植面积较大的籼稻而言，由于基因型的差异导致其组织培养特性普遍较差，转化难度明显大于粳稻。近几年来利用土壤农杆菌介导法转化籼稻也取得了一些成功，但是至今尚未建立一套像粳稻那样较为稳定的高效遗传转化体系。

已有研究表明，农杆菌介导的基因转化效率与受体基因型的愈伤组织状态、培养基、感染方式等因素有关。因此，通过优化籼稻遗传转化各阶段的参数，有望建立高效籼稻遗传转化体系。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效籼稻遗传转化方法，该方法所获得的愈伤组织质量好，适合转化，转化操作流程简便，转化率较高，所测试的2个籼稻品种都获得了成功，转化效率在35％-40％之间。

本发明通过以下技术方案实现：

一种高效籼稻遗传转化方法，包括以下步骤：

(1)愈伤组织的诱导

选取成熟良好、完整的籼稻种子的米粒，先用75％的酒精消毒3分钟，再浸泡于25％(V/V)的次氯酸钠溶液，并置于150rpm、25℃的摇床上消毒20分钟；在超净工作台上，将上述消毒后的种子用无菌水洗涤4-5次，然后转移至无菌滤纸上吸干水分，再将适量的种子接种于NB培养基，在28-30℃下光照培养8-10天，诱导愈伤组织；

(2)愈伤组织的预培养

在步骤(1)所述愈伤组织中挑选结构致密、颜色鲜亮、颗粒状的愈伤组织转入预培养基中，于28-30℃下光照培养3天用于转化；

(3)农杆菌的培养及农杆菌介导的转化

将含有目的基因的植物表达载体通过电激转化法转入农杆菌EHA105，选取阳性菌株划线于YEB抗性平板，28℃暗培养3天，再用接种针刮取米粒大小的农杆菌震荡悬浮于装有70ml农杆菌浸染液的150ml三角瓶中，并置于150rpm、28℃的摇床上摇10分钟，然后将步骤(2)所述光照培养3天的籼稻愈伤组织浸泡于上述农杆菌浸染液中，在150rpm、28℃的摇床上摇10分钟；

(4)农杆菌与愈伤组织的共培养

将步骤(3)所述浸染后的籼稻愈伤组织置于无菌滤纸上吹干，然后将所述愈伤组织转移到共培养基上，共培养基平板预先垫一张无菌滤纸，用1ml的农杆菌浸染液打湿，并除去气泡，28℃暗培养3天；

(5)抗性愈伤组织的筛选