[发明专利]一种快速检测水产品中耐药菌多样性的方法在审
| 申请号： | 201710514252.X | 申请日： | 2017-06-29 |
| 公开（公告）号： | CN107058607A | 公开（公告）日： | 2017-08-18 |
| 发明（设计）人： | 赵勇;牛丽;巴永兵;赵飞;刘海泉 | 申请（专利权）人： | 上海海洋大学 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68;C12Q1/04 |
| 代理公司： | 上海唯智赢专利代理事务所(普通合伙)31293 | 代理人： | 吴瑾瑜 |
| 地址： | 201306 上海市*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 快速 检测 水产品 耐药 多样性 方法 | ||
1.一种快速检测水产品中耐药菌多样性的方法，其特征在于，步骤包括：
(1)水产品样品匀浆并涂布在含不同浓度、类型抗生素的培养基上培养；
(2)分别提取收集菌体，获得水产品中的总菌及耐受不同浓度、类型抗生素的耐药菌，并提取DNA；
(3)PCR扩增并纯化；
(4)DGGE电泳和成像；
(5)回收目的条带，获取总菌和耐药菌DNA重新扩增并测序；
(6)分析测序结果，确定水产品样品中筛选的总菌和耐药菌特异性菌株，判断不同选择条件下水产品样品的菌株及其多样性。
2.权利要求1所述快速检测水产品中耐药菌多样性的方法，其特征在于，步骤(1)中，抗生素的浓度梯度范围为EC50值的10％～300％。
3.权利要求1所述快速检测水产品中耐药菌多样性的方法，其特征在于，步骤(3)所述PCR扩增的上游引物包含以下序列：5-CCTAC GGGAG GCAGC AG-3；并且还含有35-40bp的GC发夹结构；
下游引物包含以下序列：5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3；
所述PCR扩增的条件为：93～95℃预变性3～7min；93～95℃变性25～35s，64～66℃退火55s～1min，70～73℃延伸50s～1min，16～25个循环；93～95℃变性25～35s，54～56℃退火55s～1min，70～73℃延伸50s～1min，8～12个循环；72℃延伸8～15min。
4.权利要求1或3所述快速检测水产品中耐药菌多样性的方法，其特征在于，步骤(3)所述PCR扩增的上游引物序列为5-CGCCC GCCGC GCGCG GCGGG CGGGG CGGGG GCACG GGGGG CCTAC GGGAG GCAGC AG-3；下游引物序列为5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3；
所述PCR扩增的条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，65℃退火1min，72℃延伸1min，20个循环；94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，10个循环；72℃延伸10min。
5.权利要求1所述快速检测水产品中耐药菌多样性的方法，其特征在于，步骤(5)扩增的上游引物序列包括：5-CCTACGGGAGGCAGCAG-3，下游引物序列包括：5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3；
扩增的条件为：93～95℃预变性3～7min；93～95℃变性25～35s，64～66℃退火55s～1min，70～73℃延伸50s～1min，16～25个循环；93～95℃变性25～35s，54～56℃退火55s～1min，70～73℃延伸50s～1min，8～12个循环；72℃延伸8～15min。
6.权利要求1或5所述快速检测水产品中耐药菌多样性的方法，其特征在于，步骤(5)扩增的上游引物序列为：5-CCTACGGGAGGCAGCAG-3，下游引物序列为：5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3；扩增的条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，65℃退火1min，72℃延伸1min，20个循环；94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，10个循环；72℃延伸10min。
7.权利要求1～6任一项所述快速检测水产品中耐药菌多样性的方法，其特征在于，所述的水产品是南美白对虾。
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