[发明专利]一种快速检测水产品中耐药菌多样性的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种利用PCR-DGGE快速识别水产品中耐药菌多样性的方法。

背景技术

我国是世界上抗生素的最大生产国与消费国，过量使用或滥用抗生素现象较为普遍.根据国家食品药品监督管理局的统计数据，我国每年人均消费抗生素138g，是美国人的10倍。

抗生素广泛用于人类和动物(畜禽/鱼)的疾病防治或动物的促进长，然而，长期过量使用或滥用抗生素会对环境和人类健康构成巨大的潜在威胁，这是因为大部分的抗生素以原药及其代谢产物的方式随人、畜禽和鱼的排泄物最终进入自然环境，导致细菌耐药性增强，甚至出现超级细菌，严重威胁人类健康。

在实际的生产生活中，为了达到某种目的获得最大经济效益，人们往往认为加大抗生素的用量可以减少养殖损失，甚至盲目的错误使用抗生素的种类，导致抗生素滥用现象越来越严重，不仅危害人类的健康，对生态环境也造成了不可估量的损害。抗生素的频繁使用导致致病微生物的“伪耐久性”，会对水产动物和环境中细菌产生选择性压力，可能导致环境中的细菌成为耐药菌。抗生素的频繁使用导致致病微生物的“伪耐久性”，在水环境中，可施加选择性压力使水产动物和环境产生耐药菌。

抗菌药物在水产养殖中应用不当或增加导致细菌抗菌素耐药性的演变和传播，细菌的耐药性已经成为全球范围内极其严重的公共卫生安全问题，抗菌素耐药性致病菌构成一近几十年来最严重的威胁人类健康。

细菌产生对抗生素的耐药性会增加治疗成本，因为致病微生物的耐药性会导致治疗的失败，人类和动物病原体的抗生素耐药性的传播成为关注的重点。水产品是食品链的一部分，抗生素可以因食物的生产加工以及人的肠胃道进行转移交换，从而进行传播。因此，从水产品中的分离病原菌并获得其耐药性和参数检测对人类健康、海鲜质量保护非常重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种PCR-DGGE技术快速检测水产品耐药菌多样性的方法，以实现对水产品中不同抗生素耐药菌筛选。

本发明基于PCR-DGGE的方法，可实现快速检测水产品不同程度的耐药菌多样性。

技术方案为，先用不同类型和浓度的抗生素筛选，从水产样品中分离耐药性程度不同的耐药菌，提取DNA，根据细菌16S rDNA V3可变区设计一对通用引物进行PCR扩增，DGGE电泳分离片段并回收；再次扩增后测序，可实现快速检测水产品中耐药菌多样性。

快速检测水产品中耐药菌多样性的方法，步骤包括：

(1)水产品样品匀浆并涂布在含不同浓度、类型抗生素的培养基上培养；

(2)分别提取收集菌体，获得水产品中的总菌及耐受不同浓度、类型抗生素的耐药菌，并提取DNA；

(3)PCR扩增并纯化；

(4)DGGE电泳和成像；

(5)回收目的条带，获取总菌和耐药菌DNA重新扩增并测序；

(6)分析测序结果，确定水产品样品中筛选的总菌和耐药菌特异性菌株，判断不同选择条件下水产品样品的菌株及其多样性。分析的方法包括：NCBI Blast程序进行相似性分析、香农-威纳指数分析以及PCoA分析等。可以采用Quantity One分析软件，对样品丰富度、均匀度进行分析。

步骤(1)中，水产品样品与0.8％～0.9％NaCl溶液按1：6～10重量比混合拍打匀浆后稀释8～12倍，涂布于平板培养。35℃～38℃下培养18～24h；优选的培养温度为37℃。

步骤(1)中，抗生素的浓度梯度范围为相应水产品EC₅₀值的10％～300％，优选为EC₅₀值的25％～200％，更优选为EC₅₀值的50％～150％。

所述的抗生素为磺胺嘧啶、四环素、链霉素中的至少一种。

步骤(2)中，用0.8％～0.9％NaCl洗涤平板，收集菌体。

步骤(3)中，根据细菌16S rDNA V3可变区设计一对通用引物进行PCR扩增，其中在上游引物5’末端添加一个30-40bp的GC发卡结构。优选的，PCR扩增的引物为，341F-GC：5-CGCCC GCCGC GCGCG GCGGG CGGGG CGGGG GCACG GGGGG CCTAC GGGAG GCAGC AG-3及518R：5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3，即SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。其中GC发卡结构的序列为5-CGCCC GCCGC GCGCG GCGGG CGGGG CGGGG-3。