[发明专利]一种外周血NK细胞体外高效扩增方法

说明书

本发明提供了一种外周血NK细胞体外高效扩增方法。本发明所述的外周血NK体外高效扩增方法是通过淋巴分离液从外周血中分离单个核细胞(PBMC)，将分离的单个核细胞加入到CD16单抗，CD56单抗和低浓度的CD3单抗预先包被的培养瓶中对其进行刺激共培养，使NK细胞优先扩增；然后在第五天用IL‑15对培养的细胞进行活化，继续培养获得大量高纯度NK细胞。本发明无需对PBMC进行纯化，且不使用饲养细胞的情况下，获得大量高纯度的NK细胞，在培养17天即可获得纯度在90％以上的NK细胞，细胞扩增倍数在400倍以上，可以满足临床应用需求，节约了成本，步骤简单，操作性强。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种外周血NK细胞(Natural killercell)体外高效扩增方法的培养。

背景技术

NK细胞即自然杀伤细，1975年被发现，属于非吞噬淋巴细胞，胞浆富含穿孔素和颗粒酶，具有识别和溶解肿瘤细胞的功能。其主要来源于骨髓CD34⁺的淋巴细胞，主要存在于外周血，占外周血淋巴细胞的5％-15％，在脾脏，肝脏，虹膜，淋巴结均有表达。NK细胞的表型为CD3^-CD56⁺，有两种亚型CD56^bright和CD56^dim；CD56^brightNK细胞主要功能是分泌细胞因子，CD56^dimNK细胞有细胞毒性，占外周血NK细胞的90％。NK细胞主要通过天然的细胞毒作用，ADCC效应及分泌免疫调节性细胞因子作用诱导杀伤肿瘤细胞及病毒感染细胞，分泌的一些细胞因子还可以调节T细胞，B细胞，DC细胞，M细胞的功能和分化。在机体免疫监视，对抗病原体侵袭和防止细胞恶性转化中发挥重要作用。NK细胞的作用机制：1.直接通过细胞胞吐作用释放穿孔素和颗粒酶，活化caspase途径进而诱导靶细胞凋亡；2.表达Fas(CD95)配体与TRAIL分子，诱导靶细胞发生凋亡；3.细胞因子介导的杀伤细胞作用；4.ADCC作用。与T细胞相比，NK细胞识别抗原没有MHC限制，可以直接杀伤肿瘤细胞和外来病原体；同时NK细胞还分泌一些调节免疫反应的细胞因子。近些年，临床上将NK细胞用于免疫治疗的例子在不断增多，导致对NK细胞的需求也越来越大。

目前，体外扩增NK系统主要通过以下三种方法：1采用饲养细胞(基因修饰)的方法培养PBMC中的NK细胞；2是采用免疫磁珠的方法从PBMC中将NK细胞分离出来再培养；3单纯的细胞因子组合刺激PBMC中NK细胞的扩增。采用饲养细胞培养NK细胞可以获得高纯度大量的NK细胞，但引入了人源细胞，存在安全隐患；采用免疫磁珠的方法可以快速的获得少量NK细胞，但只能用于NK细胞研究，量少不适用于临床，且成本高，操作复杂；现有的细胞因子组合刺激PBMC中NK细胞的扩增的方法仅能使NK细胞扩增倍数在150倍左右，NK细胞纯度在60％左右，且数量和纯度上都无法满足治疗性的要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种外周血NK细胞体外高效扩增方法，即无需对NK细胞进行磁珠纯化，也不需饲养细胞，通过使用本发明的细胞因子组合就可以得到大量高效的NK细胞，操作简单，完全可以满足临床需要。

本发明所提供的外周血NK细胞体外高效扩增方法，是将外周血单核淋巴细胞接种到预先用CD16单抗，CD56单抗和CD3单抗进行包被的培养容器中，并在培养过程中添加细胞因子IL-15再次活化NK细胞。

本发明的外周血NK细胞体外高效扩增方法，其具体的操作步骤如下：

1)培养瓶的包被：

将溶有CD3单抗、CD16单抗和CD56单抗的PBS作为包被液，将包被液加入到培养瓶中进行包被；

所述的包被液中，CD3单抗、CD16单抗和CD56单抗的浓度范围分别为；1ng～100ng/ml，1μg～20μg/ml，1μg～20μg/ml。CD3单抗、CD16单抗和CD56单抗的优选浓度分别为10ng/ml，5μg/ml，5μg/ml。