[发明专利]犬新孢子虫表面蛋白SRS2基因的修饰方法及应用在审
| 申请号： | 201710521226.X | 申请日： | 2017-06-30 |
| 公开（公告）号： | CN108130330A | 公开（公告）日： | 2018-06-08 |
| 发明（设计）人： | 曹政;马力克·艾则孜;付利芝;赵扬扬;王凤莲;吕航 | 申请（专利权）人： | 重庆澳龙生物制品有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/30 | 分类号： | C12N15/30;C12N15/70;C12N1/21;C07K14/44;C12R1/19 |
| 代理公司： | 昆明合众智信知识产权事务所 53113 | 代理人： | 张玺 |
| 地址： | 402460 重*** | 国省代码： | 重庆;50 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 犬新孢子虫 表面蛋白 碱基 截去 修饰 基因 基因工程技术 密码子优化 基因基础 临床检测 目的蛋白 目的基因 新孢子虫 诱导表达 截短 种犬 应用 | ||
1.犬新孢子虫表面蛋白SRS2基因，其特征在于：在完整的SRS2基因基础上，从N-端截去168个碱基，从C-端截去75个碱基，截短后的tSRS2基因序列为SEQ ID No.1。
2.如权利要求1所述tSRS2基因序列密码子优化方法，其特征在于：利用生物信息学基因密码子优化软件(DNAWorks)和在线分析网站(http://www.jcat.de/)对tSRS2基因进行E.coli密码子优化，人工合成优化的基因序列连入pMD 18T-Simple载体，导入TOP 10感受态细胞；优化的mtSRS2基因序列为SEQ IDNo.2，翻译的氨基酸序列为SEQ ID No.3。
3.如权利要求2所述pMD 18T-mtSRS2重组载体制备重组表达质粒，其特征在于：质粒小提试剂盒提取重组pMD 18T-mtSRS2载体，并与pET 32a表达载体分别进行EcoR V和Sac I双酶切，微量胶回收试剂盒纯化、回收酶切后产物用T4DNA连接酶将mtSRS2基因片段和pET32a质粒载体进行连接，即构建成重组质粒pET 32a-mtSRS2。
4.如权利要求3所述重组质粒构建重组工程菌的方法，其特征在于：将重组质粒pET32a-mtSRS2以42℃热激90s转化至Transetta细胞，转化子涂布于含有100μg/ml的Amp+氯霉素固体平板获得抗性单克隆工程菌株pET 32a-mtSRS2-R，挑取抗性单克隆株pET32a-mtSRS2-R转接至100μg/ml的Amp+氯霉素LB液体培养基，获得抗性工程菌。
5.如权利要求4所述工程菌株的诱导表达方法，其特征在于：将重组工程菌株pET 32a-mtSRS2-R以1％体积比接种20mL含100μg/ml的Amp+氯霉素LB液体培养基，37℃、200rpm培养2h，当OD 600达到0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mM/L的IPTG进行诱导5h，以保证持续诱导表达；表达mtSRS2检测抗原，开发检测试剂盒用于临床诊断犬新孢子虫病。
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