[发明专利]犬新孢子虫表面蛋白SRS2基因的修饰方法及应用

说明书

本发明涉及一种犬新孢子虫表面蛋白SRS2基因的修饰方法及应用，属于基因工程技术领域。在完整的SRS2基因基础上，从N‑端截去168个碱基，从C‑端截去75个碱基，截短的tSRS2基因序列为SEQ ID No.1，并完成目的基因E.Coli密码子优化，诱导表达、纯化目的蛋白，用于临床检测犬新孢子虫病。

技术领域

本发明涉及一种犬新孢子虫表面蛋白SRS2基因的修饰方法及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

犬新孢子虫病是由犬新孢子虫寄生于多种哺乳动物有核细胞内的一种原虫病。该病可引起妊娠母畜流产、死胎或新生儿运动障碍和神经系统疾病等，由其引发的流产给养殖户带来了巨大的经济损失。该病的传播方式包括水平传播和垂直传播，垂直传播是其主要传播方式。其中，妊娠牛对该病尤为敏感。目前尚未开发出有效疫苗和治疗药物用于该病的防控，准确的检测、监控手段结合果断的“淘汰患畜”措施是控制该寄生虫病的关键。

基于此，提出本申请。

发明内容

针对现有犬新孢子虫病预防过程中所存在的上述缺陷，本申请首先提供了一种犬新孢子虫表面蛋白SRS2基因的修饰方法，在完整的SRS2蛋白基因的基础上，从N-端截去168个碱基，从C-端截去75个碱基，截短的tSRS2基因序列为SEQ ID No.1。

本申请第二方面的目的是对tSRS2基因序列进行E.coli密码子优化，优化的mtSRS2基因序列为SEQ IDNo.2，翻译的氨基酸序列为SEQ ID No.3。

本申请第三方面的目的是对经优化的犬新孢子虫表面蛋白mtSRS2制备重组表达质粒的方法，将经修饰的mtSRS2通过克隆至pMD 18T-Simple载体，构建pMD 18T-mtSRS2重组载体，再将重组pMD 18T-mtSRS2载体和pET 32a载体分别进行EcoR V和Sac I双酶切，纯化后用T4DNA连接酶将mtSRS2基因片段和pET 32a质粒载体进行连接，即构建成重组质粒pET 32a-mtSRS2。

本申请第四方面的目的是提供一种上述重组质粒构建重组工程菌的方法，将重组质粒pET 32a-mtSRS2用42℃热激90s转化至Transetta细胞，转化子涂布于含有100μg/ml的Amp固体平板获得抗性单克隆工程菌株pET 32a-mtSRS2-R，挑取抗性单克隆株pET32a-mtSRS2-R转接至100μg/ml的Amp LB液体培养基，获得抗性工程菌。

本申请第五方面的目的是提供一种上述工程菌株的诱导表达方法，将重组单克隆株pET 32a-mtSRS2-R按1％体积比接种于20mL含100μg/ml的Amp LB液体培养基中，37℃、200rpm培养2h左右，当OD 600达到0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mM/L的IPTG进行诱导5h，以保证持续的诱导表达。

用本申请进行构建并筛选单克隆菌株pET 32a-mtSRS2-R，用于表达检测犬新孢子虫病抗体的检测抗原。

附图说明

图1为本申请中SDS-PAGE凝胶电泳结果图，

图中，M：Mark；2：F2诱导前；3：F2诱导后；4：F3诱导前；5：F3诱导后；6：F4诱导前；7：F4诱导后；8：F5诱导前；9：F5诱导后；10：F3纯化后蛋白；11：F4纯化后蛋白。

图2为本申请中BIO-RAD GelDoc EZ凝胶成像分析结果图，

图中，M：Mark；2：F2纯化后蛋白；3：F3纯化后蛋白；4：F4纯化后蛋白；5：F5纯化后蛋白。

具体实施方式

以下结合实施例对具体方案进行说明。

1.材料

1)材料：