[发明专利]一种淀粉蔗糖酶及其用于转化生产α‑熊果苷的方法

权利要求书

1.一种淀粉蔗糖酶，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID No.2。

2.根据权利要求1所述淀粉蔗糖酶，其特征在于：其来源于Cellulomonas carbonizT26的重组淀粉蔗糖酶，其基因核苷酸序列为SEQ ID No.1。

3.权利要求2所述淀粉蔗糖酶的表达方法，其特征在于：人工合成基因SEQ ID No.1，两端设计Nde I和Xho I限制性内切酶识别序列，酶切处理后连接到载体pET-22b(+)上获得pET-CC-AS重组质粒，再转化至感受态大肠杆菌BL21中，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选到阳性克隆，获得基因工程菌株BL21(DE3)/pET-CC-AS。

4.根据权利要求3所述淀粉蔗糖酶的表达方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）重组表达载体pET-CC-AS的构建：合成带Nde I/Xho I酶切位点的Cellulomonas carboniz T26的淀粉蔗糖酶基因SEQ ID No.1连接到pET-22b(+)得到pET-CC-AS质粒；

（2）基因工程菌株BL21(DE3)/pET-CC-AS的获得：100μL BL21感受态细胞悬液中加入40ng/μL的 5μL pET-CC-AS质粒，轻轻混匀；

冰浴静置30min，质粒转化后，均匀涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃倒置培养12h得到阳性克隆，命名为重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-CC-AS；

（3）重组淀粉蔗糖酶的获得：用兼性厌氧的大肠杆菌基因工程菌表达Cellulomonas carboniz T26菌的淀粉蔗糖酶基因AS，种子在含氨苄青霉素的LB培养基中活化，再接种于新鲜的含氨苄青霉素的LB培养基中震荡培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG至1mM，温度28℃诱导表达6 h获得重组酶的大量可溶性表达物，离心获得菌体以后超声破碎，破碎上清液过Ni²⁺层析柱获得纯化后的重组淀粉蔗糖酶；

挑取基因工程菌株BL21(DE3)/pET-CC-AS单克隆至含氨苄青霉素50μg/mL的LB种子培养基中，37℃、200rpm震荡培养12h；

以1︰50比例将种子培养液接入发酵培养基37℃培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，加IPTG至终浓度1mM；

温度28℃、200rpm诱导表达6h，收集菌液；4℃、10000rpm离心10min收集菌体，弃去上清，生理盐水洗涤3次；

离心获得菌体以后超声破碎，按1g菌体︰20mL平衡缓冲液的比例加入平衡缓冲液，冰浴超声破碎；细胞超声破碎条件为功率200W，总时间15min，每破碎1s间歇3s，4℃、10000rpm离心30min去除细胞碎片；

过金属亲和层析色谱得到纯化后重组淀粉蔗糖酶：离心后上清过Chelating Sepharose Fast Flow亲和介质层析柱，低咪唑洗脱缓冲液洗脱杂蛋白，高咪唑洗脱缓冲液洗脱目的蛋白；

目的蛋白过脱盐柱脱盐以后，超滤浓缩获得重组淀粉蔗糖酶酶液，真空冷冻干燥获得淀粉蔗糖酶纯酶粉；

其中，平衡缓冲液的成分：pH7.0的含50mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠及500mM氯化钠的缓冲液；

低咪唑洗脱缓冲液成分：pH7.0的含50mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠、500mM氯化钠及50mM咪唑的缓冲液；

高咪唑洗脱缓冲液成分：pH7.0的含50mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠、500mM氯化钠及500 mM咪唑的缓冲液。

5.权利要求1所述的淀粉蔗糖酶转化生产α-熊果苷的方法，其特征在于步骤为：底物按摩尔浓度比蔗糖︰对苯二酚为1︰1配置反应液，在其中添加淀粉蔗糖酶进行催化转化，转化反应条件为：底物浓度范围为1%～30%，酶的用量为1～3U/mg对苯二酚，pH 5.5～7.0，转化反应温度为35～45℃，转化反应时间3～4h，得到含有质量浓度＞60%的α-熊果苷的反应液。