[发明专利]一种淀粉蔗糖酶及其用于转化生产α‑熊果苷的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种淀粉蔗糖酶及其用于转化生产α-熊果苷的方法，属于食品生物技术领域。

背景技术

熊果苷(arbutin)属氢醌苷化合物，化学名为4-羟基苯基-D-吡喃葡萄糖苷，存在于熊果、越橘等植物中，是一种新兴的无刺激、无过敏、配伍性强的天然美白活性物质。酪氨酸酶催化了“酪氨酸-DOPA-黑色素”的黑色素生成反应，熊果苷作为一种安全有效的酪氨酸酶抑制剂可以有效解决黑斑、老年斑、雀斑以及长时间暴露日光所造成的皮肤损伤。熊果苷有两种同分异构体分别为α-熊果苷和β-熊果苷，相关研究表明α-熊果苷对酪氨酸酶的抑制效果是β-熊果苷的十倍，而且对正常的人体细胞没有抑制作用，安全性也远远高于β-熊果苷。

传统的化学合成法合成α-熊果苷，存在步骤多、纯化复杂的问题。近年来报导了很多酶法合成的方法，如α-amylase, α-glucosidase, sucrose phosphorylase, tranglucosidase, dextransucrase，存在底物相对较贵或转化率低的问题。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种淀粉蔗糖酶及其用于转化生产α-熊果苷的方法。

本发明的技术方案，一种淀粉蔗糖酶，其氨基酸序列为SEQ ID No.2。

其来源于Cellulomonas carboniz T26（登录号：KGM11272.1）的重组淀粉蔗糖酶，其基因核苷酸序列为SEQ ID No.1。

所述淀粉蔗糖酶的表达方法如下：人工合成基因SEQ ID No.1，两端设计NdeI和Xho I限制性内切酶识别序列，酶切处理后连接到载体pET-22b(+)上获得pET-CC-AS重组质粒，再转化至感受态大肠杆菌BL21中，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选到阳性克隆，获得基因工程菌株BL21(DE3)/pET-CC-AS。

具体步骤如下：

（1）重组表达载体pET-CC-AS的构建：合成带Nde I/Xho I酶切位点的Cellulomonas carboniz T26的淀粉蔗糖酶基因SEQ ID No.1连接到pET-22b(+)得到pET-CC-AS质粒；

（2）基因工程菌株BL21(DE3)/pET-CC-AS的获得：100μL BL21感受态细胞悬液中加入5μL pET-CC-AS质粒（40ng/μL），轻轻混匀；

冰浴静置30min，质粒转化后，均匀涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃倒置培养12h得到阳性克隆，命名为重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-CC-AS；

（3）重组淀粉蔗糖酶的获得：用兼性厌氧的大肠杆菌基因工程菌表达Cellulomonas carboniz T26菌（登录号：KGM11272.1）的淀粉蔗糖酶基因AS，种子在含氨苄青霉素的LB培养基中活化，再接种于新鲜的含氨苄青霉素的LB培养基中震荡培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG至1mM，温度28℃诱导表达6h获得重组酶的大量可溶性表达物，离心获得菌体以后超声破碎，破碎上清液过Ni²⁺层析柱获得纯化后的重组淀粉蔗糖酶；

挑取基因工程菌株BL21(DE3)/pET-CC-AS单克隆至含氨苄青霉素50μg/mL的LB种子培养基中，37℃、200rpm震荡培养12h；

以1︰50比例将种子培养液接入发酵培养基37℃培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，加IPTG至终浓度1mM；

温度28℃、200rpm诱导表达6h，收集菌液；4℃、10000rpm离心10min收集菌体，弃去上清，生理盐水洗涤3次；

离心获得菌体以后超声破碎，按1g菌体︰20mL平衡缓冲液的比例加入平衡缓冲液，冰浴超声破碎；细胞超声破碎条件为功率200W，总时间15min，每破碎1s间歇3s，4℃、10000rpm离心30min去除细胞碎片；

过金属亲和层析色谱得到纯化后重组淀粉蔗糖酶：离心后上清过Chelating Sepharose Fast Flow亲和介质层析柱，低咪唑洗脱缓冲液洗脱杂蛋白，高咪唑洗脱缓冲液洗脱目的蛋白；

目的蛋白过脱盐柱脱盐以后，超滤浓缩获得重组淀粉蔗糖酶酶液，真空冷冻干燥获得淀粉蔗糖酶纯酶粉；

其中，平衡缓冲液的成分：pH7.0的含50mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠及500mM氯化钠的缓冲液；