[发明专利]用于测定生物材料中目标序列甲基化率的方法及试剂盒

权利要求书

1.用于测定转基因植物中CaMV35S启动子序列甲基化率的方法，其特征在于，采用测定待测生物材料中目标序列甲基化率的方法，用内切酶酶切处理待测转基因植物的基因组DNA，并CaMV35S启动子序列的特异性引物对酶切后的待测转基因植物的基因组DNA进行荧光定量PCR，获得酶切后的待测转基因植物的CaMV35S启动子序列的Ct值：Ct_m35S；

用所述CaMV35S启动子序列的特异性引物对未经酶切的待测转基因植物的基因组DNA进行荧光定量PCR获得对照处理的所述转基因植物CaMV35S启动子的Ct值：Ct_k35S；

计算待测转基因植物的CaMV35S启动子序列甲基化率：M_35S；

M_35S= 2^-ΔCtm；其中，ΔCt_m = Ct_m35S- Ct_k35S；

所述CaMV35S启动子特异性引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

所述内切酶为HpyCH4IV内切酶；

所述测定待测生物材料中目标序列甲基化率的方法包括：

（1）用内切酶酶切处理所述待测生物材料的基因组DNA；

所述内切酶对CpG甲基化敏感，且所述目标序列上分布有所述内切酶的切割位点序列；

经所述酶切处理后得到的酶切产物为包含有酶切后的目标序列的待测生物材料的基因组DNA；

（2）用目标序列的特异性引物对步骤（1）所得到的酶切产物进行荧光定量PCR扩增，获得酶切后的待测生物材料目标序列的Ct值：Ct_m；

所述目标序列的特异性引物基于含有所述内切酶切割位点序列的目标序列设计而得，且其上下游引物之间的扩增片段区域覆盖所述内切酶切割位点序列；

（3）用所述目标序列的特异性引物对未经所述内切酶酶切的待测转基因植物的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增，获得对照处理的所述待测生物材料目标序列的Ct值：Ct_k；

（4）计算待测生物材料的目标序列甲基化率：M；

M= 2^-ΔCtm；其中，ΔCt_m = Ct_m- Ct_k。

2.根据权利要求1所述的用于测定转基因植物中CaMV35S启动子序列甲基化率的方法，其特征在于，所述测定待测生物材料中目标序列甲基化率的方法还包括：用内参基因校准；

采用所述内参基因的特异性引物分别对步骤（1）所得到的酶切产物，和未经所述内切酶酶切的待测生物材料的基因组DNA，分别进行荧光定量PCR扩增，分别得到酶切处理的内参基因的Ct值：Ct_mnc，和对照处理的内参基因的Ct值：Ct_knc；

所述内参基因特异性引物的扩增片段区域不包含所述内切酶的切割位点序列；

所述待测生物材料目标序列甲基化率：M= 2^-ΔΔCt；其中，ΔΔCt=ΔCt_m -ΔCt_k；ΔCt_k=Ct_mnc- Ct_knc。

3.根据权利要求1所述的用于测定转基因植物中CaMV35S启动子序列甲基化率的方法，其特征在于，所述步骤（2）和步骤（3）中的PCR扩增为同时进行，且进行荧光定量PCR扩增时的模板DNA用量一致。

4.根据权利要求2所述的用于测定转基因植物中CaMV35S启动子序列甲基化率的方法，其特征在于，所述内参基因选自待测生物材料领域的公知内参基因。

5.根据权利要求1-4任一所述的用于测定转基因植物中CaMV35S启动子序列甲基化率的方法，其特征在于，所述待测生物材料为转基因植物材料。

6.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述目标序列选自DNA序列。