[发明专利]用于测定生物材料中目标序列甲基化率的方法及试剂盒有效

专利信息
申请号: 201710522272.1 申请日: 2017-06-30
公开(公告)号: CN109207618B 公开(公告)日: 2020-05-29
发明(设计)人: 谢家建;彭于发 申请(专利权)人: 中国农业科学院植物保护研究所
主分类号: C12Q1/6895 分类号: C12Q1/6895;C12Q1/6851
代理公司: 北京海虹嘉诚知识产权代理有限公司 11129 代理人: 向群
地址: 100193 *** 国省代码: 北京;11
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摘要:
搜索关键词: 用于 测定 生物 材料 目标 序列 甲基化 方法 试剂盒
【说明书】:

发明“用于测定待测生物材料中目标序列甲基化率的方法”,属于生物技术领域。所述方法包括:(1)用内切酶酶切处理所述待测生物材料的基因组DNA;(2)用目标序列的特异性引物对步骤(1)所得到的酶切产物进行荧光定量PCR扩增,获得酶切后的待测生物材料目标序列的Ct值:Ctm;(3)用所述目标序列的特异性引物对未经所述内切酶酶切的待测转基因植物的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增,获得对照处理的所述待测生物材料目标序列的Ct值:Ctk;(4)计算待测生物材料的目标序列甲基化率:M;M=2‑ΔCtm;其中,ΔCtm=Ctm‑Ctk本发明为测定转基因棉花中CaMV35S启动子的甲基化率提供了便利,具有快速简便、灵敏度高、所需实验条件不高,有非常高的实用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域,特别是涉及一种用于测定生物材料中目标序列甲基化率的方法及试剂盒。

背景技术

DNA甲基化是真核生物表观遗传学重要的机制之一,在基因的表达调控中发挥着重要的作用。DNA甲基化是真核生物基因组进行局部调整的主要方式,如基因组序列中腺嘌呤的N-6位、鸟嘌呤的N-7位和胞嘧啶的N-4位以及胞嘧啶的C-5位均可能发生甲基化,其中胞嘧啶的C-5位是最常见的甲基化位点,已成为当前该领域研究的热点问题。现有研究表明,DNA甲基化参与了生物体中多种代谢与生理生化过程,如基因的时空特异性表达(包括基因沉默)、自交不亲和、X染色体失活、衰老以及癌症的发生及物种进化等。

CaMV35S启动子是指来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子。它是转基因植物中使用频率最高的启动子,能在许多植物物种,几乎所有发育阶段及所有组织中高效表达,被广泛用于构建转基因植株,如玉米、棉花、大豆、番茄等。转基因沉默是转基因植物中经常被发现的现象,有研究表明,在转基因沉默的棉花植株中,CaMV35S启动子的甲基化是造成标记基因沉默的主要原因。因此测定转基因植物中CaMV35S启动子的甲基化是分析转基因植物是否可能发生转基因沉默的重要内容之一。

在过去数十年中,DNA甲基化的分析方法得到了长足的发展,人们已建立了多种检测DNA甲基化的方法与技术。针对基因组DNA特定序列,目前,DNA甲基化分析技术主要分为以下两类:第一类是依托各种测序技术,针对特定序列进行DNA甲基化位点检测与分析;第二类是依托PCR技术的甲基化分析技术。由于PCR技术的普遍性与快速方便等特点,因此,目前DNA甲基化分析检测方法以第二类应用最为广泛。目前常用的DNA甲基化分析是采用亚硫酸盐处理基因组DNA,再通过PCR扩增目的区域,克隆测序。通过序列比对来分析目标区域的甲基化情况。这种方法尽管获得的甲基化信息比较全面,但操作步骤多,耗时也较长,由于要进行多个克隆的测序,成本也很高。

发明内容

本发明基于本领域存在的上述缺陷,提供了一种利用荧光定量PCR快速测定待测生物材料中目标序列甲基化率的方法,尤其是测定转基因植物中CaMV35S启动子甲基化率的试剂盒及方法。采用本发明的试剂盒及方法,可快速、准确地定量检测出待测生物材料中目标序列的甲基化程度,更能准确测定出转基因植物中CaMV35S启动子甲基化率,从而进一步获知目标转基因植物中是否存在因启动子甲基化导致的可能的基因沉默。

本发明的技术方案如下:

本发明第一个方面提供一种用于测定待测生物材料中目标序列甲基化率的方法,其特征在于,包括:

(1)用内切酶酶切处理所述待测生物材料的基因组DNA;

所述内切酶对CpG甲基化敏感,且所述目标序列上分布有所述内切酶的切割位点序列;

经所述酶切处理后得到的酶切产物为包含有酶切后的目标序列的待测生物材料的基因组DNA;

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