[发明专利]一种慢性乙肝治疗性DC疫苗

权利要求书

1.一种慢性乙肝治疗性DC疫苗，其特征在于：包括经基因修饰的树突状细胞，所述经基因修饰的树突状细胞中含有粒细胞-巨噬细胞簇因子受体信号肽引导编码M-HBsAg的融合基因片段GM- CSFR SP-M-HBsAg；

所述融合基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述粒细胞-巨噬细胞簇因子受体信号肽的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

所述DC疫苗的制备方法，包括将树突状细胞负载融合基因片段的方法：将所述融合基因片段缓慢插入慢病毒表达载体pLent-C-GFP中，包装成携带GM- CSFR SP-M-HBsAg编码基因的慢病毒，同时，将慢性乙型肝炎患者的体外周血单个核细胞诱导成imDC，将携带GM-CSFR SP-M-HBsAg编码基因的慢病毒感染所述imDC，并将感染后的imDC经成熟因子诱导，得到成熟DC疫苗；所述M-HBsAg的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的一种慢性乙肝治疗性DC疫苗，其特征在于，所述DC疫苗的制备方法，还包括将所述慢性乙型肝炎患者的体外周血单个核细胞诱导成imDC的方法：采集慢性乙型肝炎病人外周静脉血 50ml，利用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，在培养基中，37℃，5％的CO₂条件下培养2-3小时后，倒掉悬浮T细胞，留取贴壁细胞，并加入细胞因子rhIL-4、rhGM-GSF，诱导单个核细胞分化成DC，每隔48小时更换新培养基，培养第5天得到imDC。

3.如权利要求1所述的一种慢性乙肝治疗性DC疫苗，其特征在于：所述成熟因子为成熟因子TNF-α。

4.如权利要求1所述的一种慢性乙肝治疗性DC疫苗，其特征在于，所述DC疫苗的制备方法，还包括将所述融合基因片段包装成携带 GM-CSFR SP-M-HBsAg编码基因的慢病毒的方法：将慢病毒包装细胞系293T接种于含有DMEM +10％FBS 的10cm培养皿中，37℃，5％的CO₂条件下培养，贴壁率为70％-80％后进行转染；慢病毒包装质粒和包含融合基因片段的慢病毒表达载体pLent-C-GFP采用磷酸钙转染法共转染293T细胞；转染24h后，细胞明显增大、呈球形，细胞核变大、变圆，贴壁能力下降而易脱落；48h后在倒置荧光显微镜下观察到细胞内有绿色荧光蛋白表达；72h后，收集上清，过滤除菌，得到重组GM-CSFR SP-M-HBsAg 慢病毒，所述重组GM-CSFR SP-M-HBsAg慢病毒在-80℃低温冰箱中保存备用。