[发明专利]一种家蚕浆细胞特异性分子标记鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于生物学领域，尤其涉及一种家蚕浆细胞特异性分子标记鉴定方法。

背景技术

家蚕是一种重要经济昆虫，具有极高的经济价值，对提高人类生存质量做出了积极的贡献。在上下五千年的悠久文明历史中，丝绸之路和丝绸文化是一块绚丽的文化瑰宝，也是中国古老文明的象征。时至今日，在当前农村经济中，蚕丝产业仍然是部分农村地区的支柱产业之一。蚕病一直是严重影响蚕丝产业的重要因素，每年因蚕病带来的经济损失约占整个产业的20％，而且没有有效的预防措施。因此，研究家蚕免疫防御机制，解析宿主对病原菌的免疫应答反应，最终能够有效防御蚕病的发生是蚕桑研究人员重要的工作内容之一。昆虫属开放式循环系统，整个体腔都浸浴在血淋巴中，血淋巴起着运输养料、激素和代谢废物，维持正常生理所需的血压、渗透压和离子平衡，参与中间代谢，清除解离的组织碎片，修补伤口，对侵染物产生免疫反应和调节体温等诸多功能。在血淋巴中，血细胞是细胞免疫应答反应的主要执行者，在免疫反应中发挥着重要的作用。根据形态，昆虫主要包含五种血细胞类型：原血细胞、颗粒细胞、浆细胞、拟绛色细胞和小球细胞，它们在免疫反应中有着不同的角色分工，共同协助昆虫应对来自体内外的各种挑战。作为一种重要的鳞翅目模式，随着基因组三部曲的顺利完成，转基因和基因编辑技术的建立与完善，家蚕成为变态与发育研究的重要材料之一。家蚕饲养方便，血细胞含量丰富，与果蝇相比具有更好的操作性，是造血及血细胞功能研究的重要介质之一。更为重要的是，鳞翅目昆虫约占据农林害虫的70％，研究家蚕造血与其调控机制，探究血细胞的功能，也可以为鳞翅目病虫害的防治提供新的策略。现阶段家蚕血细胞分类主要依据形态学和化学染色，虽然传统的方法简单方便和快捷，但是血细胞形态多样，仅仅依靠肉眼观察有时很难准确判断细胞类型，此外传统方法也要研究人员有较为丰富的的鉴定经验，都极大地影响了家蚕血细胞的研究。

综上所述，现有技术存在的问题是：传统的方法判断细胞类型比较困难，判断不准确。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种家蚕浆细胞特异性分子标记鉴定方法。

本发明是这样实现的，一种家蚕浆细胞特异性分子标记鉴定方法家蚕浆细胞特异性分子标记鉴定方法，所述家蚕浆细胞特异性分子标记鉴定方法包括：

步骤一，通过对家蚕细胞的转录组生物信息学数据分析，共筛选获得浆细胞特异性性表达的候选基因；

步骤二，通过实时荧光定量PCR对基因在mRNA水平上验证，家蚕基因Integrinβ2和Integrinβ3在浆细胞里特异性地高表达；

步骤三，采用家蚕基因Integrinβ2和Integrinβ3特有的引物序列，经过PCR技术对这两个基因的序列进行克隆扩增，并将所得的扩增产物进行测序验证；

步骤四，采用家蚕基因Integrinβ2和Integrinβ3特有的RACE引物序列，利用RACE扩增技术获得其cDNA全长序列；

步骤五，根据cDNA全长序列，进行家蚕基因Integrinβ2和Integrinβ3的原核表达及蛋白纯化，并制备获得抗体；

步骤六，利用所获得Integrinβ2和Integrinβ3的抗体在家蚕细胞水平，以及转基因家蚕个体水平等验证，确定Integrinβ2和Integrinβ3能特异性地标记家蚕循环血细胞中的浆细胞。

进一步，所述步骤一中共筛选获得141个浆细胞特异性性表达的候选基因。

进一步，所述步骤三中Integrinβ2和Integrinβ3特有的引物序列为：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

进一步，所述步骤四中Integrinβ2和Integrinβ3特有的RACE引物序列为：SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

本发明的优点及积极效果为：可以准确判断细胞类型；利用转录组分析，共筛选获得139个颗粒细胞和141个浆细胞特异性表达候选基因。利用荧光定量PCR，对转录组结果进行验证。其中Integrinβ2和Integrinβ3高表达于浆细胞。随后，成功鉴定克隆了这些候选基因，经原核表达和蛋白纯化获得相应抗原后免疫动物制备抗体。免疫荧光结果表明Integrinβ2和Integrinβ3能特异标记家蚕血液中的浆细胞。

附图说明

图1是本发明实施提供的家蚕浆细胞特异性分子标记鉴定方法流程图。

图2是本发明实施提供的引物序列表。

图3是本发明实施提供的主要仪器及设备表。

图4是本发明实施提供的实验试剂表。