[发明专利]一种采用磁性微球分离外周血中游离核酸的试剂盒及方法

权利要求书

1.一种采用磁性微球分离外周血中游离核酸的试剂盒，包括裂解缓冲液、结合缓冲液、蛋白酶K、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，其特征在于，还包括偶联Oligo(dT)₂₅的磁性微球和含有Poly-A的非特异捕获探针，非特异捕获探针的序列为L(k)₂-d(k)₅-L(k)₂-d(k)₅-L(k)₂-dT₅dA₁₅。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解缓冲液为组成中包括浓度为0.4-0.8M的氯化苄、8-15mM的乙二胺四乙酸二钠、3-8mM的二硫苏糖醇、0.1-0.5mM的氢氧化钠和0.1-2wt.％的十二烷基硫酸锂的水溶液。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述结合缓冲液为组成中包括浓度为3-6M的氯化苄、0.5-1M的盐酸胍、0.5-1.5M的乙酸和5-13wt.％的乙酸钾的水溶液。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述漂洗缓冲液为组成中包括浓度为5-15mM的三羟甲基氨基甲烷、0.1-0.3M的氯化苄和0.1-2的乙二胺四乙酸二钠的水溶液。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱缓冲液为浓度5-15mM的三羟甲基氨基甲烷的水溶液。

6.一种采用磁性微球分离外周血中游离核酸的方法，所述方法包括以下步骤：

①将50-300μL外周血的样本加入至无核酸酶的离心管中，加入400-600μL裂解缓冲液和10-25μL蛋白酶K，混匀反应5-20min，得裂解样本；

②向裂解样本中加入80-150μL结合缓冲液和20-50μL包含偶联Oligo(dT)₂₅的磁性微球及带有Poly-A的非特异捕获探针的核酸结合试剂，混匀后室温静置15-30min，将离心管于磁力架上磁吸附1-3min，吸弃上清，得磁珠-核酸复合物，其中非特异捕获探针的序列为L(k)₂-d(k)₅-L(k)₂-d(k)₅-L(k)₂-dT₅dA₁₅；

③向磁珠-核酸复合物中加入700-1000μL漂洗缓冲液，混匀后磁吸附1-3min，吸弃上清，得纯化的磁珠-核酸复合物，向纯化的磁珠-核酸复合物中加入50-100μL洗脱缓冲液，晃动下室温孵育3-8min，得纯化的游离核酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述所述裂解缓冲液为组成中包括浓度为0.4-0.8M的氯化苄、8-15mM的乙二胺四乙酸二钠、3-8mM的二硫苏糖醇、0.1-0.5mM的氢氧化钠和0.1-2wt.％的十二烷基硫酸锂的水溶液。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述结合缓冲液为组成中包括浓度为3-6M的氯化苄、0.5-1M的盐酸胍、0.5-1.5M的乙酸和体积比5-13％的乙酸钾的水溶液。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述漂洗缓冲液为组成中包括浓度为5-15mM的三羟甲基氨基甲烷、0.1-0.3M的氯化苄和0.1-2的乙二胺四乙酸二钠的水溶液。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述洗脱缓冲液为浓度5-15mM的三羟甲基氨基甲烷的水溶液。