[发明专利]一种采用磁性微球分离外周血中游离核酸的试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种采用磁性微球分离外周血中游离核酸的试剂盒及方法，属于生物技术领域，采用磁性微球分离外周血中游离核酸的试剂盒及方法基于包括偶联Oligo(dT)25的磁性微球和含有Poly‑A、序列为L(k)2‑d(k)5‑L(k)2‑d(k)5‑L(k)2‑dT5dA15的非特异捕获探针捕捉外周血样品中的核酸并通过磁性分离，配合进一步优化配方的裂解缓冲液、蛋白酶K、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，从而实现了如下优点：快速裂解，高效漂洗和洗脱，外周血样本中的游离核酸提取效率高，少量样本即可获得足够量的游离核酸；易操作，安全、绿色；大大简化了步骤，提高了实验效率，且重复性好，更利于高通量自动化操作。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及核酸纯化，具体涉及一种采用磁性微球分离外周血中游离核酸的试剂盒及方法。

背景技术

早在1948年，Mandel等就发现了外周血中有游离核酸，研究发现，游离核酸不仅可以应用于胎儿性别、RHD血型、Y染色体连锁的遗传疾病的诊断与预防，还可以应用于检测肿瘤、癌症的发生以及骨髓移植后嵌合状态的研究。1989年，Stroun等研究表明，游离核酸中部分基因具有肿瘤组织基因的类似特征；几年后，Vasioukhin等于血浆游离核酸中发现了突变的N-ras，进一步为两者相关性提供了依据，至此，游离核酸开始被用作一种预测肿瘤发生的新型生物标记。近几年，除肿瘤外的其他疾病也出现了游离核酸的报道，如急性(心脑血管疾病)或恶性疾病(系统性免疫疾病)、需机械通气危重症、中风、脊髓小脑性共济失调、心肌梗塞、急性登革热病等。Lo等认为在免疫学上，胚胎对于母体类似于肿瘤对于机体，可能在母体血浆中存在游离的胎儿DNA，1997年，他们通过实时PCR从一孕男胎妇女血液游离DNA扩增出胎儿Y染色体特异序列，首次证明孕妇外周血中存在胎儿游离DNA，为非创伤产前诊断开辟了一条新途径。随后在1998年，他们发现胎儿游离核酸在妊娠早期便存在于孕妇血液中，且浓度随孕周的延长而增加。同年，他们建立方法以检测孕中期RhD阴性孕妇外周血中是否存在RhD基因，从而揭开了利用母体血浆中游离胎儿DNA进行产前诊断研究的序幕。随着研究的广泛和深入，游离核酸还可用于三体综合征、地中海贫血症、连锁遗传性疾病和早产的产前诊断。

然而，外周血中游离核酸数量较少，另一方面，提取体系的复杂性使得提取纯度和效率上困难度较大，应用常用的苯酚-氯仿抽提法、硅膜离心柱吸附法及磁珠吸附法提取分离核酸时，显现出诸多不足，苯酚-氯仿抽提法的主要原理是基于DNA在不同溶剂中溶解度不同从而分离纯化DNA，其优点在于提取DNA产率较高，成本低，但缺点主要是费时费力，提取DNA纯度低，且大量使用有毒溶剂，对环境及操作者危害大，还难以实现自动操作。目前市面商品化核酸提取试剂盒大多是采用裂解法结合硅膜离心吸附柱，该方法简单快速，能有效的去除样本中的各种PCR抑制物，获得较纯的DNA，但是游离核酸提取效率低，且成本较高，同时需要高速离心，不适合临床常规使用和高通量操作。

近几年磁珠法提取收到热衷，主要原理是在磁性微球(或者说磁珠，主要为铁氧体)表面以共价键的形式偶联-COOH，-NH₂，-OH，-COH，-SH，-SO₃等活性基团，制备成具有磁性的亲和吸附剂，然后与生物样品共同孵育后，目标分子能够迅速被磁珠捕获，在磁场作用下从液相中沉降，经洗涤可分离得到表面结合有目标分子的磁性微球复合物，改变洗涤条件可以将目标分子从磁性微球上洗脱下来，该方法操作简便、快速，获得的核酸纯度高，尤其适合游离核酸的提取。但目前的磁珠法从样本中分离游离核酸的提取试剂盒操作复杂，需要先在56℃条件下用蛋白酶K和裂解缓冲液裂解样本，然后冷却至室温，再加入无水乙醇混匀，室温放置5分钟后再加入磁珠悬浮液进行混匀，经过三次漂洗步骤后置于室温晾干10-15分钟。裂解及漂洗步骤的繁琐性导致其自动化操作程度低，仪器普适性差，同时也无法保证核酸提取的重复性。针对于血浆样品中游离核酸提取同样出现提取效率低，导致提取时需要更多的起始样本量或者额外添加Carrier RNA或糖原才能满足后续检测的要求，这造成了成本的增加和临床应用的难度的增加。因此迫切需要开发简单快速、稳定高效、价格便宜及普适性好的磁珠法游离核酸提取的方法及试剂盒。

发明内容