[发明专利]干血斑中7种类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法

权利要求书

1.干血斑中7种类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述的7种类固醇激素分别为：17-羟基孕酮、雄烯二酮、双氢睾酮、孕酮、皮质醇、11-脱氧可的松和醛固酮；所述的检测方法包括如下步骤：

(1) 血斑样本前处理：用3/16打孔器打4个血斑到12*75mm的玻璃试管中，加入含有4种内标物质的内标萃取液200μL，超声60min提取，置于高速离心机5000r/min涡旋15min，得到提取液，将提取液转入带有滤膜的96孔板中，离心后置于氮气吹仪中55℃吹干、然后加入100μL 50%的甲醇溶液复溶，覆盖铝箔；放入涡旋振荡器中以750rpm的速度涡旋震荡15min，进行上机检测；

（2）采用液相色谱串联质谱法检测经上述步骤处理的样本，利用液相色谱进行梯度分离，目标化合物在电喷雾正、负离子模式下电离，采用多反应监测扫描模式，再采用同位素内标定量法分析,利用分析软件以标准物与内标物的浓度比为X轴,标准物与内标物峰面积比为Y轴,建立校准曲线,并计算出干血斑中7种类固醇激素的含量，得到检测结果；

所述液相色谱条件如下：

流动相A为水溶液，流动相B为纯甲醇溶液，柱温40℃，检测时间10min，

采用梯度洗脱方式，程序为0.01-0.5 min 45% B，0.5-2.0min 45%-55%B，2.0-4.0 min55%-90% B，4.0-6.0 min 90% B，6.0-6.1min 90%-45%B；

进样量10μL；流速0.35mL/min；柱温40℃；色谱柱：Shimadzu-Packed XR-ODSⅡ，2mm×75mm×2.2μm；

所述质谱条件如下：电喷雾电离源，多反应监测模式正、负离子模式，电喷雾电压为±5500V，离子源温度为 400℃，各个目标化合物的其它质谱参数锥孔电压DP、碰撞能量CE、碰撞室出口电压CXP如下表所示：

所述的含有4种内标物质的内标萃取液的制备方法为：分别称取一定量的d8-17-羟基孕酮、d4-皮质醇、d7-醛固酮和移取d3-双氢睾酮的氘代化合物4种内标物质，用甲醇溶解或稀释到1mg/mL，接着取各溶解或稀释后的同位素内标溶液混合配制成每个内标物质浓度都为50ng/mL的内标混合萃取液，即为含有4种内标物质的内标萃取液，所用的萃取液为甲醇；

所述血斑样本包括干血斑标准曲线样本和需要检测的血斑样本；其中，所述干血斑标准曲线样本按照如下步骤制备得到：

（1）空白全血的制备：采集健康志愿者的血样，采集后置于高速冷冻离心机3000r/min离心15min，离心分离血清和红细胞；在红细胞中加入等体积的0.9%氯化钠溶液进行洗涤，反复旋转试管进行充分清洗，然后再置于高速冷冻离心机上3000r/min离心15min，如此进行四次清洗，然后将上层的溶液去掉；在红细胞中加入与红细胞体积比为55:45的经过活性炭洗涤的空白血清，即制成人造空白全血；

（2）标准溶液的配制： 准确称取7种类固醇激素标准物质，用甲醇配制成1mg/mL的标准储备溶液，使用时再用甲醇稀释到所用浓度，置于-20℃的冰箱中保存；

（3）标准干血斑的制备：用甲醇稀释的一系列浓度的标准溶液加入到空白全血中，制成0.5、1、2、10、50、100ng/mL的标准系溶液，用移液器分别吸取50μL全血标准样品滴于干燥洁净的滤纸片的采样圈的中心位置，然后将滤纸片正面朝上置于血片晾干架上，室温条件下自然晾干，晾干后置于密封的塑料袋中，放入-20℃冰箱中储存备用。