[发明专利]干血斑中7种类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法

说明书

本发明属于血液检测技术领域，具体涉及一种干血斑中7种类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，所述的7种类固醇激素分别为：17‑羟基孕酮、雄烯二酮、双氢睾酮、孕酮、皮质醇、11‑脱氧可的松和醛固酮。该方法检测经过预处理的干血斑中上述7种类固醇激素，样品经甲醇沉淀蛋白，并超声提取，提取后过滤净化，以甲醇和水作为流动相，经C18色谱柱进行梯度分离，目标化合物在电喷雾正、负离子模式下电离，采用多反应监测扫描模式，内标定量法分析。本发明方法灵敏度高、特异性强、准确性好，分析时间短，精密度及加标回收率满足检测要求。

技术领域

本发明属于血液检测技术领域，具体涉及一种干血斑中7种类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法。

背景技术

类固醇激素是一类脂溶性小分子激素，是由胆固醇经一系列酶催化而来。人体内的类固醇激素主要包括性激素和肾上腺皮质激素。类固醇激素在人体中对于新陈代谢、维持内环境稳定、生长、发育及生殖行为等方面起着重要的调节作用。

人体类固醇激素的升高或者降低与一些临床疾病如先天性肾上腺增生、多囊卵巢综合症、肾上腺皮质功能不全等疾病息息相关。其中，先天性肾上腺皮质增生症（congenital adrenal hyperplasia,CAH）是一组由于类固醇激素合成代谢过程中，某种酶的缺陷导致激素合成障碍为主要特征的常染色体隐性遗传疾病。在类固醇合成代谢中，游离胆固醇经过5种酶的催化，最终合成皮质醇、醛固酮、雄激素三大类固醇激素。不同的酶缺陷导致终产物合成不足或缺乏，导致不同的生化和临床表现，即使同一种酶缺陷，由于酶缺陷的程度不同，临床表现严重程度不一。目前，CAH的筛查主要是通过17-羟基孕酮的检测，针对21-羟化酶缺乏症进行筛查。

发明内容

本发明的目的在于提供一种准确性高、灵敏度高的干血斑中7种类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，该方法可同时对类固醇代谢通路中17-羟基孕酮，雄烯二酮，11-脱氧可的松，皮质醇，孕酮，双氢睾酮以及醛固酮7种激素进行定量检测，通过检测干血滤纸片中7种类固醇激素的水平及相关的比值，为一次筛查多种CAH的类型提供技术基础，具有潜在临床应用价值。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种干血斑中7种类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法，所述的7种类固醇激素分别为：17-羟基孕酮、雄烯二酮、双氢睾酮、孕酮、皮质醇、11-脱氧可的松和醛固酮；所述的检测方法包括如下步骤：

(1) 血斑样本前处理：用3/16打孔器打4个血斑到12*75mm的玻璃试管中，加入含有4种内标物质的内标萃取液200μL，超声60min提取，置于高速离心机5000r/min涡旋15min，得到提取液，将提取液转入带有滤膜的96孔板中，离心后置于氮气吹仪中55℃吹干、然后加入100μL 50%的甲醇溶液复溶，覆盖铝箔；放入涡旋振荡器中以750rpm的速度涡旋震荡15min，进行上机检测；

（2）采用液相色谱串联质谱法检测经上述步骤处理的样本，利用液相色谱进行梯度分离，目标化合物在电喷雾正、负离子模式下电离，采用多反应监测扫描模式，再采用同位素内标定量法分析,利用分析软件以标准物与内标物的浓度比为X轴,标准物与内标物峰面积比为Y轴,建立校准曲线,并计算出干血斑中7种类固醇激素的含量，得到检测结果；

所述液相色谱条件如下：

流动相A为水溶液，流动相B为纯甲醇溶液，柱温40℃，检测时间10min，

采用梯度洗脱方式，程序为0.01-0.5 min 45% B，0.5-2.0min 45%-55%B，2.0-4.0min 55%-90% B，4.0-6.0 min 90% B，6.0-6.1min 90%-45%B；

进样量10μL；流速0.35mL/min；柱温40℃；色谱柱：Shimadzu-Packed XR-ODSⅡ，2mm×75mm×2.2μm；