[发明专利]鸭源性成分PCR检测用阳性标准分子、制备及检测方法

权利要求书

1.一种鸭源性成分PCR检测用阳性标准分子，其特征在于，所述阳性标准分子为能够自主复制的质粒分子，所述质粒分子中包含鸭18SrRNA基因序列和鸭线粒体基因序列。

2.一种如权利要求1所述的阳性标准分子的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

（1）分别设计鸭18SrRNA基因序列的扩增引物18S-F、18S-R和鸭线粒体基因序列的扩增引物ANAS-F、ANAS-R；

鸭18SrRNA基因序列的扩增引物18S-F、18S-R为：

18S-F ：5'-GCGTCGACAGCCTGAGAAACGGCTACC-3'，

18S-R ：5'-AACTGCAGTGCTGGCACCAGACTTGC-3'；

鸭线粒体基因序列的扩增引物ANAS-F、ANAS-R为：

ANAS-F：5'-CCATGAAGCCCCATTCTCA-3'，

ANAS-R：5'-CCGGTGGCAACAAAGAAAGT-3' ；

（2）以鸭基因组为模板基因组，用所述鸭18SrRNA基因序列的扩增引物和鸭线粒体基因序列的扩增引物，进行PCR扩增，得到鸭18SrRNA基因序列和鸭线粒体基因序列；

（3）将所述鸭18SrRNA基因序列和鸭线粒体序列分别连接至pMD18-T载体，得到鸭18SrRNA重组子和鸭线粒体重组子；

（4）将所述鸭18SrRNA重组子和鸭线粒体重组子通过限制性内切酶酶切并拼接，得到阳性标准分子。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述限制性内切酶为Sal I酶和PstI酶。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述PCR扩增的反应体系为10uM上游引物1μL，10uM下游引物1μL，模板基因组3μL，Taq酶12.5μL，加ddH₂O调整反应体系的体积为25μL；所述PCR扩增的反应条件为94℃变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共进行40次循环，得到PCR产物；

将所述PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，目的产物用胶回收试剂盒纯化，得到PCR纯化产物，即为鸭18SrRNA基因序列和鸭线粒体基因序列。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，将所述鸭18SrRNA基因序列和鸭线粒体基因序列分别与pMD18-T载体进行连接，4℃下过夜连接，得到鸭18SrRNA重组子18S-pMD18-T和鸭线粒体重组子ANAS-pMD18-T。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，将所述鸭18SrRNA重组子和鸭线粒体重组子分别用Sal I酶和PstI酶进行双酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，将回收片段连接，4度过夜连接，摇床均匀混匀2小时进行质粒转化，得到转化质粒；

将所述转化质粒进行凝胶电泳分离，回收大分子质粒条带进行重组克隆质粒筛选回收，得到重组克隆；

将所述重组克隆通过常规PCR 验证、Sal I 和Pst I 的酶切验证及酶切产物测序验证，得到的质粒分子18S-ANAS-pMD18-T即为阳性标准分子。

7.一种如权利要求1所述的阳性标准分子的检测方法，其特征在于，利用特异性检测引物和探针，以所述阳性标准分子为模板进行实时荧光PCR反应，所述特异性检测引物和探针包括以下两组：

鸭18SrRNA基因序列的特异性检测引物18S-F、18S-R和探针18S-P：

18S-F：5'-GCGTCGACAGCCTGAGAAACGGCTACC-3' ，

18S-R：5'-AACTGCAGTGCTGGCACCAGACTTGC-3'，

18S-P：5'-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-3'；

鸭线粒体基因序列的特异性检测引物ANAS-F、ANAS-R和探针ANAS-P：

ANAS-F：5'-CCATGAAGCCCCATTCTCA-3'，

ANAS-R：5'-CCGGTGGCAACAAAGAAAGT-3' ，

ANAS-P：5'-TCGCCGACAGCGTCTACGGCT-3'。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述探针的5'端修饰有荧光报告基团，3'端修饰有荧光淬灭基团。