[发明专利]鸭源性成分PCR检测用阳性标准分子、制备及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种鸭源性成分PCR检测用阳性标准分子、制备及检测方法。

背景技术

随着生活水平的不断提高，人们对食品质量安全的重视程度也相应提高。一些不法分子为牟取暴利，低价购入不明动物源的劣质肉用以制作肉制品，或使用香精等制作假冒肉制品，严重扰乱肉制品市场，损害消费者正当权益，带来极大的安全隐患。因此，加强肉制品检测，准确检测出食品中相应动物源成分的含量，是防治劣质肉制品流入市场的关键措施。

荧光定量聚合酶链式反应(real-time Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction ，FQ-PCR)方法是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术的一种，是公认的目前核酸检测的最常用定量检测方法。实时荧光定量PCR技术在PCR反应体系中加入能特异标记PCR产物的荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对样品进行定量分析，实现了PCR技术由定性到定量的飞跃。

使用FQ-PCR技术对样品进行检测时需要阳性参考物质作为对照，以保证实验结果的可靠性。因此，阳性参考物质的质量与实验结果的准确性密切相关。现阶段，对于动物源性成分的检测过程中所用的阳性参考物质通常是动物基因组DNA。其中，鸭成分检测过程中，提取鸭基因组DNA过程复杂，制备非常不方便。由于鸭基因组DNA的稳定性不能满足长期贮存及经常性使用的需要，因此，每次进行鸭成分检测时，都需要重新制备鸭基因组DNA作为阳性参考物质，影响鸭成分测量的稳定性。

发明内容

本发明提供了鸭源性成分PCR检测用阳性标准分子、制备及检测方法，以解决PCR检测过程中阳性参考物质制备复杂、储存困难的问题。

第一方面，本发明提供了一种鸭源性成分PCR检测用阳性标准分子，为能够自主复制的质粒分子，所述质粒分子中包含鸭18SrRNA基因序列和鸭线粒体基因序列。

第二方面，本发明还提供了一种用以制备第一方面所述阳性标准分子的制备方法，包括以下步骤：

（1）分别设计鸭18SrRNA基因序列的扩增引物18S-F、18S-R和鸭线粒体基因序列的扩增引物ANAS-F、ANAS-R；

鸭18SrRNA基因序列的扩增引物18S-F、18S-R为：

18S-F ：5'-GCGTCGACAGCCTGAGAAACGGCTACC-3'，

18S-R ：5'-AACTGCAGTGCTGGCACCAGACTTGC-3'；

鸭线粒体基因序列的扩增引物ANAS-F、ANAS-R为：

ANAS-F：5'-CCATGAAGCCCCATTCTCA-3'，

ANAS-R：5'-CCGGTGGCAACAAAGAAAGT-3'；

（2）以鸭基因组为模板基因组，用鸭18SrRNA基因序列的扩增引物和鸭线粒体基因序列的扩增引物，进行PCR扩增，得到鸭18SrRNA基因序列和鸭线粒体基因序列；

（3）将鸭18SrRNA基因序列和鸭线粒体序列分别连接至pMD18-T载体，得到鸭18SrRNA重组子和鸭线粒体重组子；

（4）将鸭18SrRNA重组子和鸭线粒体重组子通过限制性内切酶酶切并拼接，得到阳性标准分子。

可选地，所述限制性内切酶为Sal I酶和PstI酶。

可选地，步骤（2）中， PCR扩增的反应体系为10uM上游引物1μL，10uM下游引物1μL，模板基因组3μL，Taq酶12.5μL，加ddH₂O调整反应体系的体积为25μL；所述PCR扩增的反应条件为94℃变性5 min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共进行40次循环，得到PCR产物；

将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，目的产物用胶回收试剂盒纯化，得到PCR纯化产物，即为鸭18SrRNA基因序列和鸭线粒体基因序列。

可选地，步骤（3）中，将鸭18SrRNA基因序列和鸭线粒体基因序列分别与pMD18-T载体进行连接，4℃下过夜连接，得到鸭18SrRNA重组子18S-pMD18-T和鸭线粒体重组子ANAS-pMD18-T。