[发明专利]无物种限制的真核生物同时进行基因敲除和基因过表达

权利要求书

1.一种多基因同时过表达和/或敲除方法，包括：

将至少一个CAR构建于同一载体，并用同一个启动子驱动表达，并且不同CAR之间利用2A短肽分开；和/或

将至少一个sgRNA构建于同一载体，不同sgRNA分别用启动子U6驱动表达，并且不同的U6-sgRNA串联在一起；

将所述载体电转染导入同一细胞或个体，其中所述至少一个CAR在同一细胞或个体同时实现基因过表达，所述至少一个sgRNA在同一细胞或个体同时实现基因敲除。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个sgRNA在同一细胞或个体同时实现敲除胞内表达靶基因和胞膜表达靶基因，或同时实现敲除一条信号通路的上下游靶基因或几条平行信号通路的不同靶基因。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个CAR为单个过表达的Tn-MUC1 CAR或Her2 CAR，所述至少一个sgRNA为单个靶向胞内表达靶基因hGATA3的sgRNA，并且CAR载体和sgRNA载体(的DNA片段)被串联构建为一体。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个CAR为过表达的Tn-MUC1 CAR和/或Her2CAR，所述至少一个sgRNA为两个分别靶向胞内表达靶基因hGATA3和胞膜表达靶基因hPD1的sgRNA，并且CAR载体和sgRNA载体被串联构建为一体。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述细胞为HEK293T细胞或人原代T细胞。

6.根据权利要求3或4所述的方法，其中Tn-MUC1CAR或Her2CAR是利用PiggyBac-transposon载体依次串联人启动子、CSF2RA嵌合受体信号肽、胞膜外抗原结合区、铰链区、胞内信号传导区和T2A短肽连接的抗性基因puromycin制备而成的。

7.根据权利要求6所述的方法，其中胞膜外抗原结合区为用于结合Tn-MUC1或Her2蛋白的CD19单链抗体(scFv)，依次串联c-myc表位标记、CD8 Hinge嵌合受体铰链、CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区。

8.根据权利要求7所述的方法，其中胞内信号传导区为CD28-4-1BB-CD3ζ，CD28和4-1BB为嵌合受体共刺激因子。

9.一种多基因同时过表达和/或敲除装置，包括：

PBMC细胞准备系统；

Amaxa电转试剂盒；

电转染系统，接收来自Amaxa电转试剂盒的电转试剂并将其和用于过表达基因的质粒和用于基因敲除的质粒混合，形成电转混合物体系；并接收来自PBMC细胞准备系统的PBMC细胞且在其中加入所述混合物进行电转染；

CD3阳性T细胞富集系统，包含用于偶联CD3/CD28抗体的磁珠；以及

筛培系统，用于筛选并培养扩增转染后的T细胞。