[发明专利]无物种限制的真核生物同时进行基因敲除和基因过表达

说明书

技术领域

本发明涉及对真核生物同时进行基因敲除和基因过表达。

背景技术

基因支持着生命的基本构造和性能。储存着生命的种族、血型、孕育、生长、凋亡等的全部信息。人类根据需要进行基因操作，选择目的基因(DNA片段)在体外构建载体，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的细胞或个体或治疗人类疾病的目的。基因操作的方式有很多种，主要可分为基因的过表达和降低表达或基因敲除。基因过表达技术已经非常成熟，主要由一个启动子启动外源基因表达即可。基因敲除技术则不然。传统的基因操作通过基于全能胚胎干细胞的同源重组实现。需要构建一个复杂的同源重组载体，包括了阳性和阴性筛选抗性等，效率非常低，而且操作复杂、耗时长，很难用于实际应用。

一些生物性状受到激活基因和抑制基因的同时调节。在对这些性状进行调控时，往往需要对影响这些性状的激活基因和抑制基因同时进行敲除和过表达。由于传统的基因敲除非常复杂，因而利用传统的方式同时进行基因敲除和基因过表达非常困难。通常，为了实现在同一个体或同一细胞进行基因敲除和基因过表达这一目的，需要先进行基因敲除再进行基因过表达，或者是先进行基因过表达再进行基因敲除来实现。很显然，这样的策略操作步骤繁琐、效率低、耗时长。要进行多基因的敲除或过表达，则更是难上加难。特别是新分离的原代细胞，因为生长时间短，基因导入困难，不能先进行基因敲除或过表达，再进行过表达或基因敲除，必须同时进行基因敲除和基因过表达。这样传统的策略几乎是不可能的。

近年来出现了一类新的基因敲除技术，这类技术利用不同的机制，将核酸内切酶导向到基因组的特定位点，核酸内切酶将DNA剪切，造成DNA双链断裂，实现DNA序列改变。为区别于80年代发明的基因打靶技术，这类新的技术被称之为基因编辑技术(Gene editing)。这类技术主要包括ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9。CRISPR/Cas9是2012年人们研发出的一种新型基因组修饰技术--规律成簇的间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)。CRISPR是细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。CRISPR广泛存在于众多原核生物基因中，其中II型为CRISPR/Cas，免疫系统依赖Cas9内切酶家族靶向和剪切外源DNA。在这一系统中，crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与trancrRNA(trans-activating RNA)结合形成双链RNA，此trancrRNA/crRNA二元复合体(现在融合成为了sgRNA，single guided RNA)指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶向位点剪切双链DNA，其中Cas9的HNH核酸酶结构域剪切互补链，其RuvC-like结构域剪切非互补链，形成双链DNA缺口，然后细胞会借助同源重组机制(homologous recombination)或者非同源末端连接机制(non-homologous end joining)对断裂的DNA进行修复。如果细胞通过非同源重组机制进行修复，将会产生随机的突变、缺失或插入，造成基因敲除的效果。如果细胞通过同源重组机制进行修复，会用另外一段DNA片段填补断裂的DNA缺口，因而会引入一段“新的”遗传信息，造成基因敲入效果。

发明内容

本发明的目的是同时实现无物种限制的真核生物的基因敲除和基因过表达。

根据本发明的第一方面，提供了一种(非治疗目的)多基因同时过表达和/或敲除方法，包括：

将至少一个CAR构建于同一载体，并用同一个启动子驱动表达，并且不同CAR之间利用2A短肽分开；和/或

将至少一个sgRNA构建于同一载体，不同sgRNA分别用启动子U6驱动表达，并且不同的U6-sgRNA串联在一起；

将所述载体电转染(脂质体转染或电穿孔)导入同一细胞或个体，其中所述至少一个CAR在同一细胞或个体同时实现基因过表达，所述至少一个sgRNA在同一细胞或个体同时实现基因敲除。

根据本发明的一个具体实施例，所述至少一个sgRNA可以在同一细胞或个体同时实现敲除胞内表达靶基因和胞膜表达靶基因，或同时实现敲除一条信号通路的上下游靶基因或几条平行信号通路的不同靶基因。所述至少一个sgRNA优选为两个分别靶向胞内表达基因hGATA3和胞膜表达基因hPD1的sgRNA。