[发明专利]用于鉴别辽参的实时荧光PCR引物检测方法及应用

说明书

本发明公开一种快速、低成本、无污染及操作方便的用于鉴别辽参的实时荧光PCR特异引物，特异引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；通用引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；鉴别方法是提取待测样品DNA；以所得到的DNA为模板,分别以特异引物和通用引物进行实时荧光PCR扩增；分别检测特异引物和通用引物进行实时荧光PCR扩增曲线Ct值,如特异引物和通用引物实时荧光PCR均有扩增曲线Ct值,则被测样本为辽参。

技术领域

本发明涉及一种海参的检测方法，尤其是一种快速、低成本、无污染及操作方便的用于鉴别辽参的实时荧光PCR引物及方法。

背景技术

海参（sea cucumbers, holothurians）属于棘皮动物门海参纲，广义的海参包括海参纲所有的种类。海参同人参、燕窝、鱼翅齐名，是世界八大珍品之一，不仅是珍贵的食品，也是名贵的药材。据《本草纲目拾遗》中记载：海参，味甘咸，补肾，益精髓，摄小便，壮阳疗痿，其性温补，足敌人参，故名海参。研究表明海参具有提高记忆力、延缓性腺衰老，防止动脉硬化以及抗肿瘤等作用。我国海域出产的可以食用的海参有20多种，辽参（仿刺参）主要产于黄海、渤海海域，又称北方刺参，由于体壁厚，营养价值丰富，是刺参中的顶级佳品，尤其大连海域的仿刺参，更被称为“参中之冠”。但是目前市场上出现了冒充产地，以次充好的问题。

传统海参的鉴别方法主要是观察其外部形态特征，但如果失去原有的形态（胶囊、含片等），则给鉴定造成很大干扰，工作强度大且准确性低。随着分子生物学的发展，DNA条形码作为生物鉴定的“有效身份证”被广泛应用。由于线粒体细胞色素c氧化酶亚基I(cytochrome oxidase subunit I gene, COI)具有分子结构简单、严格的母系遗传、无重组、易扩增、进化速率快、多拷贝等优点，被选为DNA条形码动物种类鉴别的通用引物。实时荧光PCR技术可以直接对其源性成分进行检测，由于在整个操作过程中都进行闭管操作，可有效减少实验过程中的污染危险且具有较高的灵敏度、特异性和准确性，但迄今为止，还没有关于采用实时荧光PCR技术鉴别辽参的相关报道。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种快速、低成本、无污染及操作方便的用于鉴别辽参的实时荧光PCR特异引物及方法。

本发明的技术解决方案是：一种用于鉴别辽参的实时荧光PCR引物,其特征在于所述引物核苷酸序列如下：

特异引物：

上游引物HS-COIF：5'TCCAGACATGGCTTTCCCAC 3'，

下游引物HS-COIR：5'AGAATTGAGGAGGCACCAGC 3'；

通用引物：

上游引物HS-16SF：5'AAAACAGAAAGACGAGAAGACCCT 3'，

下游引物HS-16SR：5'CGCTGTTATCCCTGCGGTAG 3'。

一种用于鉴别辽参的实时荧光PCR方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：

a. 提取待测样品DNA；

b. 以所得到的DNA为模板,分别以特异引物和通用引物进行实时荧光PCR扩增，所用引物的核苷酸序列如下：

特异引物：

上游引物HS-COIF：5'TCCAGACATGGCTTTCCCAC 3'，

下游引物HS-COIR：5'AGAATTGAGGAGGCACCAGC 3'；

通用引物：