[发明专利]一株耐高温酿酒酵母菌株及其构建

说明书

技术领域：

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一株耐高温酿酒酵母菌株及其构建方法。

背景技术：

燃料乙醇是目前全球公认的最为成熟的汽油代替燃料。作为一种可以再生的液体燃料，燃料乙醇在缓解大气污染、减少温室气体排放、降低对进口石油依赖、激活农村经济以及提高农户收入等方面都起着十分重要的作用，因此在全球多个国家和地区得到了推广使用。燃料乙醇已经成为国际上最为关注的可再生能源之一。2015年全球燃料乙醇的产量达到了983 亿升，占总生物液体燃料(包括乙醇、生物柴油和氢化植物油)产量(约1307亿升)的75％，成为全球最主要的液体可再生燃料，也是交通领域公认的汽油代替燃料。20世纪70年代，一些学者在对纤维素发酵产乙醇的研究过程中，为了防止糖积累和终产物的抑制作用，进而提高纤维素酶的催化水解效率，提出了同步糖化发酵(Simultaneous Saccharification and Fermentation，SSF)模式，并受到了广泛的重视。目前主流的干法乙醇工艺都采用了同步糖化发酵技术，即将糖化酶和酵母同时加入发酵罐中，糖化酶将液化工段所获得的糊精进一步分解为酵母可以利用的还原糖，酵母将还原糖转化为乙醇。然而，SSF中有一个最重要的问题就是最佳酶解温度(45℃～50℃)和乙醇的发酵温度(25℃～35℃)不协调，这使得酵母菌的发酵和纤维素的酶解难以同步进行，因此选育耐高温酵母菌是解决这一问题的关键。

在乙醇的发酵过程中，当发酵醪液的温度超过38℃时，就必须使用冷却水进行降温，否则就会对酿酒酵母的活性产生抑制，影响乙醇的产率以及还原糖的利用率，增大生产成本。高温发酵具有发酵速度快、更适用于同步糖化发酵工艺、缩短发酵周期、节省冷却水用量、降低发酵原料黏度、降低生产成本等优点，因此，选育耐高温的酿酒酵母菌株在工业应用方面具有重要意义。本研究在酿酒酵母AY12的基因背景下，结合ARTP离子诱变、基因组重排以及高温驯化等育种手段，选育耐高温酿酒酵母。然而关于耐高温酿酒酵母，目前还没有比较成熟的市场化产品。

发明内容：

本发明解决的技术问题是利用ARTP离子诱变、基因组重排和高温驯化构建出一株耐高温酿酒酵母菌株。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供的酿酒酵母菌株是对高温具有一定耐受性的酵母菌株。获得高耐受酿酒酵母菌株的出发酵母菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315，保存于中国工业微生物菌种保藏管理中心，公众可购买获得。

所述的耐高温酵母在同样的生长条件下与原始菌株相比耐高温能力提高了一倍以上而且耐盐能力明显强于原始菌株。

所筛选出的菌株经过驯化后与安琪耐高温干酵母相比乙醇产量也明显提高，而且残糖含量也有所下降。同时细胞存活率也明显提高。

由于酿酒酵母的生活史具有特殊性，其单倍体和双倍体细胞均可以以营养体的形式存在。诱变剂处理酿酒酵母的作用是随机的，当处理单倍体细胞时，有可能出现几个基因同时发生突变，但其中某个突变会导致菌株死亡的情况。这就导致了在筛选过程中某些正向突变的丢失；相反，如果用二倍体细胞进行诱变，即使产生了一个致死突变，只要其等位基因没有发生该突变，则菌株依然可以存活下来，从而扩大了突变点的范围。为了成功构建原始突变文库，用于之后的基因组重排，我们最终决定选用二倍体酿酒酵母菌株作为出发菌株。

因为与实验室保存菌株AY12和AY15相比，从工业生产菌种中分离出来的菌株AY12-G 具有良好的发酵性能以及高温耐受性，故选用菌株AY12-G作为ARTP离子诱变、基因组重排和高温驯化相结合育种实验中的出发菌株。