[发明专利]一株适量产高级醇的酿酒酵母菌株及其构建方法

权利要求书

1.对酿酒酵母出发菌株中编码酿酒酵母细胞质支链氨基酸转氨酶的BAT2基因启动子3’端进行部分敲除以弱化BAT2启动子，再通过两步重组无缝精确插入，选育出的适量产高级醇的酿酒酵母菌株。

2.如权利要求1所述的适量产高级醇酿酒酵母菌株，其特征在于，所述出发菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315。

3.如权利要求1所述的适量产高级醇酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酿酒酵母具有正常的生长性能并且具有正常的发酵性能以及产酒精能力，在30℃玉米原料浓醪发酵中总高级醇含量相比于出发菌株降低了28.3％。正丙醇、异丁醇、异戊醇的含量分别降低了29.2％，34.6％，19.9％。

4.如权利要求1所述的适量产高级醇酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法是通过融合PCR技术和整合型载体质粒YIplac211介导的两步基因整合法，将BAT2启动子3’端进行部分截断，敲除序列大小为166bp。采用无痕敲除来实现。

5.如权利要求4所述的适量产高级醇酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，具体步骤包括：

用PCR方法获得突变URA3基因片段，将其通过醋酸锂化学转化法导入到酿酒酵母出发菌株，通过同源重组实现出发菌株的URA3基因突变；

用PCR方法扩增788bp的弱化的BAT2启动子序列以及1000bp的下同源臂序列，通过融合PCR，将两段序列融合成无缝片段；然后将该片段通过双酶切连接至酵母整合质粒YIplac211上，获得能够进行整合敲除的质粒；

在整合敲除质粒的上游同源臂或者下游同源臂中，选择合适的单一酶切位点，将质粒酶切线性化；

通过醋酸锂化学转化法，将线性化的整合敲除质粒导入酿酒酵母，在不含尿嘧啶的酵母合成培养基进行筛选以获得发生第一步整合重组的酵母突变株；将经过鉴定的发生第一步整合重组的酵母突变株，利用含有5-氟乳清酸合成培养基平板反向筛选获得发生第二步整合重组的酵母突变株；

将二步整合重组的酵母突变株和URA3基因正常的α型菌株在KAC培养基上进行杂交产孢，筛选出带有正常URA3基因的a型及α型酵母突变菌株，完成突变ura3标记基因的回复。

6.如权利要求2所述的适量产高级醇酿酒酵母菌株在白酒生产中的应用。