[发明专利]一株适量产高级醇的酿酒酵母菌株及其构建方法

说明书

技术领域：

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一株适量产高级醇的酿酒酵母菌株及其构建方法。

背景技术：

高级醇类物质是白酒风味的一类重要风味物质，不但有助于白酒成香、呈味，更能增加其甜感，调节白酒口感，同时也是构成酯类的前体物质。高级醇类物质的含量过高或过低都会对白酒的风味产生不良影响，若白酒中高级醇类物质含量适宜，可使白酒的口感柔和且丰满，味道独特；但含量过高则会产生杂味异味，饮用后易上头，影响身体健康；高级醇含量不足，酒的味道将变得稀薄单调。因此控制高级醇在白酒中的含量在适量的范围内，使得醇类物质在白酒风味中发挥积极作用对改善白酒酒质显得尤为重要。

对于调节酿酒酵母中高级醇的合成，BAT2基因在其中起着关键性的作用，BAT2基因编码的氨基酸转氨酶控制的转氨作用是酿酒酵母支链氨基酸分解代谢合成高级醇的第一步。研究发现使用弱化BAT2基因启动子的方法，可以构建降低高级醇的酿酒酵母菌株，该突变株所得的发酵最终产物中高级醇含量通过启动子工程发生改变但菌株的生长性能和发酵性能不受影响。

氨基酸转氨酶的酶活力的改变会影响酵母细胞产高级醇的能力。通过对BAT2基因启动子的弱化，进而实现BAT2基因的表达强度的调控，最终实现对酿酒酵母细胞最终发酵产物中高级醇含量的控制。采用融合PCR方法可以实现基因片段的精确无缝拼接，而且不受酶切位点的限制，避免基因改造带来的未知影响。该方法利用融合PCR和整合型载体质粒 YIplac211介导的两步整合方法，在无外源基因残留的前提下，实现对BAT2启动子3’端的部分敲除。构建的工程菌株可以安全应用到酿酒生产中，同时融合PCR介导的两步整合方法和启动子截断调控目的基因表达的方法可以广泛应运到酵母以及其他微生物的基因表达调控，促进了基因表达调控的发展。

发明内容：

本发明解决的技术问题是提供一株适量产高级醇的酿酒酵母菌株及其构建方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了适量产高级醇的酿酒酵母菌株及其构建方法。获得适量产高级醇酿酒酵母菌株的出发酵母菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315，保存于中国工业微生物菌种保藏管理中心，公众可购买获得。

所述适量产高级醇的酿酒酵母菌株在正常的生长性能和发酵性能不受影响的情况下，在 30℃静止玉米浓醪发酵约84小时产生的高级醇总量相对于发菌株降低了28.3％。正丙醇、异丁醇、异戊醇的含量分别降低了29.2％，34.6％，19.9％。

所述适量产高级醇的酿酒酵母菌株具体可以通过对出发菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315的BAT2基因启动子3’端进行部分敲除(截断启动子的166bp)来实现。

上述基因无痕敲除可以用以下方法实现。各步骤所涉及具体操作方法参考现有文献报道，如Joseph Sambrook等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995。

用PCR方法获得突变ura3片段，将其通过醋酸锂化学转化法导入到酿酒酵母出发菌株，通过同源重组实现出发菌株的URA3基因突变；

用PCR方法分别扩增788bp的BAT2启动子部分缺失序列，以及1000bp的BAT2表达区序列，然后通过融合PCR完成两段序列的无缝融合；将该片段通过双酶切整合至酵母整合质粒YIplac211上，以获得能够进行整合敲除的质粒；

在整合敲除质粒的上游同源臂或者下游同源臂中，选择合适的单一酶切位点，将质粒酶切线性化；

通过醋酸锂化学转化法，将线性化的整合敲除质粒导入到ura3缺陷型中，用不含尿嘧啶的酵母合成培养基筛选发生第一步整合重组的酵母突变株；将经过鉴定的发生第一步整合重组的酵母突变株，利用含有5-氟乳清酸的合成培养基平板反向筛选，获得发生第二步整合重组的酵母突变株；

用二步整合重组的酵母突变株和带有正常URA3基因的α型菌株在KAC培养基上进行杂交产孢，然后分出带有正常URA3基因的a型及α型酵母突变菌株，以此方法完成ura3标记基因的回复。

本发明所述酿酒酵母菌株可应用于白酒发酵生产中。

有益效果：

1、本发明提供一种适量产高级醇的酿酒酵母菌株以及构建方法，解决了启动子工程调节高级醇产量过高的问题。