[发明专利]一种脯氨酸‑4‑羟化酶及其重组表达宿主菌的应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物技术领域，尤其是涉及一种芽孢杆菌密码子优化的脯氨酸-4-羟化酶基因表达的酶及其在枯草芽孢杆菌中合成反式-4-羟脯氨酸的应用。

背景技术

反式-4-羟脯氨酸(trans-4-hydroxyproline，HYP)，白色片状晶体或粉末，分子式C₅H₉NO₃，分子量大小为131.10。HYP是脯氨酸-4-羟化酶羟化游离L-脯氨酸后的产物，其在第四号位碳上带有羟基，属于L-脯氨酸的衍生物，且同L-脯氨酸一样具有不对称性。HYP一种高附加值的小品种氨基酸，广泛应用于医药、化工、动物饲料和美容业等方面。

在医药方面，HYP作为原料可用于合成消炎药、碳青霉烯类。在化工上，HYP可作为手性原料合成多种聚合物。在动物饲料应用上，添加反式-4-羟脯氨酸可防止因甘氨酸合成不足而导致的营养不良现象。此外，反式-4-羟脯氨酸用于化妆品中，可作为氧化剂调整细胞的氧化还原状态。目前，国内生产HYP的主要方法是生物提取法，利用动物蛋白来源，如骨胶、猪皮等为原料，经酸、碱水解后提取反式-4-羟脯氨酸。该方法纯化步骤长，成本高，且废弃物污染严重而化学合成方法合成成本高，不适合工业生产。随着微生物资源的开发和生物技术的发展，利用微生物发酵生产反式-4-羟脯氨酸成为了可能。微生物发酵法生产反式-4-羟脯氨酸，主要是通过外源脯氨酸-4-羟化酶基因的引入，在生物体内架构一条HYP合成途径，进而转化游离的L-脯氨酸合成反式-4-羟脯氨酸。

脯氨酸-4-羟化酶，是一种能够将游离的L-脯氨酸羟化成反式-4-羟脯氨酸的特异性酶。目前国内尚未有报道利用重组枯草芽孢杆菌合成反式-4-羟脯氨酸。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种脯氨酸-4-羟化酶及其重组表达宿主菌的应用。本发明依据芽孢杆菌密码子偏好性优化脯氨酸-4-羟化酶基因，并制备含有该基因的重组枯草芽孢杆菌，用于合成反式-4-羟脯氨酸；本发明为利用枯草芽孢杆菌合成反式-4-羟脯氨酸的工业化生产提供了良好的前景。

本发明的技术方案如下：

一种脯氨酸-4-羟化酶，编码该所述酶的基因序列如SEQ ID No.1所示；所述酶的蛋白质序列如SEQ ID No.2所示。

一种含有所述脯氨酸-4-羟化酶的重组枯草芽孢杆菌，所述菌株的重组方法包括如下步骤：

(1)制备来源于指孢囊菌(Dactylosporangium sp.RH1)，经过枯草芽孢杆菌密码子优化的脯氨酸-4-羟化酶基因p4h；

(2)将步骤(1)制得的脯氨酸-4-羟化酶基因p4h连接到含有木糖启动子的诱导型表达载体pHY-Bs.xyl上，制得含有脯氨酸-4-羟化酶的重组质粒pHY-Bs.xyl-P4H；

(3)将步骤(2)所得的重组质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中，得到重组菌WB600/pHY-Bs.xyl-P4H，即所述重组枯草芽孢杆菌。

一种所述重组枯草芽孢杆菌的应用，该重组枯草芽孢杆菌可用于合成反式-4-羟脯氨酸。

一种含有所述脯氨酸-4-羟化酶的经遗传改造的重组枯草芽孢杆菌，所述菌株的构建方法如下：

(1)敲除原始菌株WB600的谷氨酰胺合成酶基因glnA；且过表达谷氨酸激酶基因proB，构建了重组菌WB601；

(2)制备来源于指孢囊菌(Dactylosporangium sp.RH1)，经过枯草芽孢杆菌密码子优化的脯氨酸-4-羟化酶基因p4h；

(3)将步骤(2)制得的脯氨酸-4-羟化酶基因p4h连接到含有木糖启动子的诱导型表达载体pHY-Bs.xyl上，制得含有脯氨酸-4-羟化酶的重组质粒pHY-Bs.xyl-P4H；

(4)将步骤(3)制得的重组质粒pHY-Bs.xyl-P4H转入WB601中，得到重组菌WB601/pHY-Bs.xyl-P4H，即所述经遗传改造的重组枯草芽孢杆菌。

一种所述经遗传改造的重组枯草芽孢杆菌的应用，该重组枯草芽孢杆菌可用于合成反式-4-羟脯氨酸。

本发明有益的技术效果在于：

本发明依据芽孢杆菌密码子偏好性，对脯氨酸-4-羟化酶基因密码子进行了相关优化；通过理性改造脯氨酸代谢途径，提升了重组菌反式-4-羟脯氨酸的合成能力。