[发明专利]一种可筛选及对比人源多种干细胞分泌因子生物等效性的方法及其应用

权利要求书

1.一种检测待测试剂中人源多种干细胞生长因子的生物等效性的方法，其特征在于，所述方法包括将80-120μL所述待测试剂与阳性对照体系分别加入80-120μL浓度为5-8×10⁴个/mL的Balb/c3t3细胞培养液中，继续培养70-75h后使用MTT比色法检测Balb/c3t3细胞增殖率；

其中，所述阳性对照体系的建立包括如下步骤：

S1.传代培养人源干细胞并收集所述干细胞培养混合物的上清液，于4℃条件下将所述上清液加入超滤管中，3000-5000g离心50-70min收集分子量小于100kDa的蛋白获得超滤液，重复该步骤3-6次；其中，所述超滤管使用前需加入过膜超纯水，冰浴5-10分钟后倒出；

S2.向所述1体积的超滤液中加入13-15体积的无菌TGE缓冲液，离心后混匀获得干细胞生长因子浓缩液；

S3.检测所述干细胞生长因子浓缩液的总蛋白浓度，向所述干细胞生长因子浓缩液中加入含有0.3-0.5％胎牛血清的维持培养基稀释，获得所述总蛋白浓度分别为1mg/mL、0.25mg/mL、0.0625mg/mL和0.0156mg/mL的4个梯度的含有干细胞生长因子的阳性对照体系；

S4.将80-120μL所述总蛋白浓度为1mg/mL、0.25mg/mL、0.0625mg/mL和0.0156mg/mL的反应液分别加入体积相同的浓度为5-8×10⁴个/mL的Balb/c3t3细胞培养液中，培养70-75h后使用MTT比色法检测Balb/c3t3细胞增殖率。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述干细胞为人源间充质干细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述超滤管为货号910096的Amicon Ultra-15超滤管。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述维持培养基为添加了3-5mmol/L谷氨酰胺、50-200μg/mL青霉素和50-200μg/mL链霉素的RPMI1640培养基。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤S2中离心速度为3000-5000g，时间为30-45min。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述无菌TGE缓冲液为经超滤膜过滤除菌后的TGE缓冲液。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤S2中混匀的操作为使用移液枪沿超滤管边缘轻轻吹打混匀。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤S4中Balb/c3t3细胞培养液为含有0.3-0.5％胎牛血清的RPMI1640培养液。

9.权利要求1-8中任意一项所述的方法在化妆品和/或生物药物配方筛选中的应用。