[发明专利]一种可筛选及对比人源多种干细胞分泌因子生物等效性的方法及其应用

说明书

本公开公开了一种可筛选及对比人源多种干细胞分泌因子生物等效性的方法及其应用；所述可筛选及对比人源多种干细胞分泌因子生物等效性的检测方法包括将待测试剂和阳性对照体系分别用于培养Balb/c3t3细胞，并检测其增殖率；所述阳性对照体系的建立需要经过浓缩与调节浓度的步骤；所述方法可将干细胞生长因子的浓缩到1000‑3000倍；然后通过本公开中所述的技术方案同时对多个待测物进行批量化筛选，可以降低检测成本。所述方法可应用于化妆品、生物药物配方筛选领域，能够简化检测步骤，提高检测的效率，降低检测成本。

技术领域

本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种可筛选及对比人源多种干细胞分泌因子生物等效性的方法及其应用。

背景技术

皮肤覆盖人类整个体表，具有屏障保护、水分保持、感觉及维持新陈代谢等作用。研究发现，皮肤的自我更新、新陈代谢功能维持及组织损伤修复依赖于于干细胞，人间充质干细胞可通过旁分泌作用，分泌诸如表皮生长因子(EGF)、内皮细胞生长因子(VEGF)、纤维母细胞生长因子(FGF)等多种细胞因子，对皮肤组织新陈代谢能力的维持及修复、再生起到促进作用。但是，由于人来源的干细胞及细胞分泌因子均不在化妆品原料目录中，人源干细胞生长因子无法直接应用于化妆品领域。如何在纷繁复杂的化妆品原料和配方中筛选出与人源多种干细胞生长因子效果相等同的化妆品成分和配方，有效评判化妆品的安全性和有效性是政府监管部门、化妆品制造企业和消费者共同关注的问题。

建立一种可筛选及对比人源多种干细胞分泌因子生物等效性的方法，可应用于化妆品研发、制造与监管领域，对化妆品配方中的有效成分及浓度进行筛选和测试，替代动物试验以保障化妆品的安全性与功效性，具有极大的实际应用价值。另外，也可以应用于生物医药领域，筛选、评价具有和人源多种干细胞分泌因子相等同的生物学效应的化合物。

发明内容

本公开的目的是提供一种可筛选及对比人源多种干细胞分泌因子生物等效性的方法，该方法可以同时对多个待测物及其浓度进行批量化筛选，筛选出生物活性等同于人源多种干细胞分泌因子的待测试剂，提高筛选效率，降低检测成本。

为了实现上述目的，本公开提供一种可筛选及对比人源多种干细胞分泌因子生物等效性的方法，所述方法包括将80-120μL所述待测试剂与阳性对照体系分别加入80-120μL浓度为5-8×10⁴个/mL的Balb/c3t3细胞培养液中，继续培养70-75h后使用MTT比色法检测Balb/c3t3细胞增殖率；

其中，所述阳性对照体系的建立包括如下步骤：

S1.传代培养人源干细胞并收集所述干细胞培养混合物的上清液，于4℃条件下将所述上清液加入超滤管中，3000-5000g离心50-70min收集分子量小于100kDa的蛋白获得超滤液，重复该步骤3-6次；

S2.向所述1体积的超滤液中加入13-15体积的无菌TGE缓冲液，离心后混匀获得干细胞生长因子浓缩液；

S3.检测所述干细胞生长因子浓缩液的总蛋白浓度，向所述干细胞生长因子浓缩液中加入含有0.3-0.5％胎牛血清的维持培养基稀释，获得所述总蛋白浓度分别为1mg/mL、0.25mg/mL、0.0625mg/mL和0.0156mg/mL的4个梯度的含有干细胞生长因子的阳性对照体系；

S4.将80-120μL所述总蛋白浓度为1mg/mL、0.25mg/mL、0.0625mg/mL和0.0156mg/mL的反应液分别加入体积相同的浓度为5-8×10⁴个/mL的Balb/c3t3细胞培养液中，培养70-75h后使用MTT比色法检测Balb/c3t3细胞增殖率。

通过上述技术方案，本公开提供的可筛选及对比人源多种干细胞分泌因子生物等效性的方法可将干细胞分泌因子的浓缩倍数达到1000-3000倍；然后将其稀释后作为阳性对照体系可以同时对多个不同浓度的待测试剂进行批量化筛选，提高筛选效率，降低检测成本。