[发明专利]一种中山杉品种406叶肉原生质体分离、纯化及高效转化的方法

权利要求书

1.一种中山杉品种406叶肉原生质体分离、纯化及高效转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以中山杉生长30天长势良好的组培苗幼嫩叶片为材料，对材料进行30h的黑暗预处理；

（2）对叶肉原生质体进行分离和纯化，步骤包括：

1）用刀片将中山杉片从叶柄上迅速分离下来，轻轻将叶片切成0.5-1mm宽的叶条；

2）配制酶液：500μL 200mM MES溶液，3.75mL 0.8 M甘露醇，500μL 0.2M KCl，25μLddH₂O混合后，70℃水浴10 min后，立即加入150μL纤维素酶Cellulase，75μL 果胶酶Pectinase，55℃水浴15min，0.20mm的膜过滤灭菌，酶液应新鲜制备，且呈浅棕色；

3）将叶片切好后舒展地放入酶液中，25℃恒温培养箱中暗陪5小时酶解，当酶解液体变绿时，轻轻摇晃培养容器促使原生质体释放出来；

4）沿培养容器边沿轻轻加入预冷的10 mL W5溶液，稀释含有原生质体的酶液；

5）轻轻混匀后，使用200目的筛子过滤除去未酶解的叶子以及杂质；

6）将滤液加入50mL的圆底离心管，4℃，900rpm水平离心5min，沉淀原生质体；

7）小心除去上清后，用5 mL W5溶液重悬沉淀在圆底管底部的原生质体；

8）普通光学显微镜下使用血球计数器观察计数；

9）冰上静止30 min，再次去除上清，然后用适量的MMG溶液重悬原生质体，使其终浓度达到6×10⁵/mL，用于后期的质粒转化；

（3）从15~20mL过夜培养菌液抽提50~80 μg质粒，质粒为载体p2FGW7.0；

（4）PEG介导进行原生质体转化，具体操作：

1）加入20μL的已提纯的质粒（10-20 μg）至2mL离心管中；

2）加入200μL的已经分离纯化的中山杉叶肉原生质体，轻柔混合；

3）加入220μL的PEG溶液，0.2 M mannitol，100 mM CaCl₂，轻柔拍打离心管完全混合；

4）黑暗环境中，冰浴诱导转化混合物5-15分钟；

5）室温下用800 μL的W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应；

6）室温下用台式垂直离心机1000rpm，离心6min，然后利用移液枪轻轻去除上清；

7）用200μL的WI溶液轻柔重悬原生质体于多2mL的离心管中，所述WI溶液包括4 mMMES、0.5 M mannitol和20 mM KCl ，pH 5.7；

8）室温下黑暗培养，诱导原生质体表达转化的载体18小时以上；

9）荧光显微镜下观察GFP标签的表达。