[发明专利]一种中山杉品种406叶肉原生质体分离、纯化及高效转化的方法

说明书

本发明公开了一种中山杉品种406叶肉原生质体分离、纯化及高效转化的方法，包括：1）以中山杉生长30天长势良好的组培苗幼嫩叶片为材料，对材料进行30h的黑暗预处理；2）对叶肉原生质体进行分离和纯化；3）从15~20mL过夜培养菌液抽提50~80μg质粒，质粒为载体p2FGW7.0；4）PEG介导进行原生质体转化。本发明的中山杉品种406叶肉原生质体分离、纯化及高效转化的方法，其操作简单易行，除可以获得大量、完整、纯净的中山杉叶肉原生质体外，还可以达到高达80%的质粒转化率。从而解决了无法深入研究中山杉基因功能的难题，也为其他针叶树种原生质体瞬时表达体系建立提供一定的参考及借鉴，将在林木基因工程领域有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种中山杉品种406（Taxodium hybrids‘zhongshansha406’）叶肉原生质体分离、纯化及高效转化的方法。

背景技术

植物原生质体即指“通过质壁分离，能够和细胞壁分开的那部分细胞物质”，换言之原生质体就是除去全部细胞壁的“细胞”，仍具有细胞全能性。近年来，随着基因组学和蛋白质组学的发展，植物原生质体的瞬时表达已被科学家们广泛利用进行基因功能高通量分析，由于原生质体的代谢过程、对植物激素的应答、以及对环境因素的反应都与完整的植物细胞或组织细胞完全相同，因此原生质体为我们提供了一个分析植物信号转导途径的方便而有力的工具。这项技术己经被广泛的应用于启动子活性分析，基因亚细胞定位以及蛋白质间的相互作用等。而目前植物原生质体的研究主要集中于草本模式植物拟南芥、烟草，木本模式植物杨树等一些双子叶植物中。

中山杉是江苏省中国科学院植物研究所从落羽杉×墨杉杂交组合中选育出来的优良无性系，具有速生，耐水淹，耐盐碱，抗病虫害，干形优美等特点。目前中山杉的生理学，形态学研究已经获得一定成果，但是同大多数针叶树种一样，由于其遗传转化体系尚不成熟，造成中山杉分子生物学相关功能研究受到限制。

发明内容

发明目的：针对现在技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种中山杉品种406叶肉原生质体分离、纯化方法。本发明的另一目的是提供一种中山杉品种406叶肉原生质体质粒高效转化的方法。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种中山杉品种406叶肉原生质体分离、纯化及高效转化的方法，包括以下步骤：

1）以中山杉生长30天长势良好的组培苗幼嫩叶片为材料，对材料进行30h的黑暗预处理；

2）对叶肉原生质体进行分离和纯化；

3）从15~20mL过夜培养菌液抽提50~80μg质粒，质粒为载体p2FGW7.0；

4）PEG介导进行原生质体转化。

步骤2）中，具体操作：

1）用刀片将中山杉片从叶柄上迅速分离下来，轻轻将叶片切成0.5-1mm宽的叶条；

2）配制酶液：500μL 200mM MES溶液，3.75mL 0.8 M甘露醇，500μL 0.2M KCl，25μLddH₂O混合后，70℃水浴10 min后，立即加入150μL纤维素酶Cellulase，75μL果胶酶Pectinase，55℃水浴15min，0.20mm的膜过滤灭菌，酶液应新鲜制备，且呈浅棕色；

3）将叶片切好后舒展地放入酶液中，25℃恒温培养箱中暗陪5小时酶解，当酶解液体变绿时，轻轻摇晃培养容器促使原生质体释放出来；

4）沿培养容器边沿轻轻加入预冷的10 mL W5溶液，稀释含有原生质体的酶液；

5）轻轻混匀后，使用200目的筛子过滤除去未酶解的叶子以及杂质；