[发明专利]用于检测CDKN2B基因变异的试剂盒及CDKN2B基因变异率的定量检测方法

权利要求书

1.一种用于检测CDKN2B基因变异的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于CDKN2B基因变异率的定量检测；其中，所述试剂盒包含一对靶基因特异性引物和两条不同荧光标记的探针；

所述一对靶基因特异性引物为突变区引物和保守区引物，所述两条不同荧光标记的探针分别为FAM标记的非突变探针，和vic标记的突变探针；

其中，

①突变区引物和vic标记的突变探针的核苷酸序列分别为：

正向引物：CTTATGCAGTTCCTCACCAAAGTTT；

逆向引物：GGATAGGAAGAGAACCGCAAGTT；

vic标记的突变探针：VIC-AGGCAACAAATCCA-NONE；

②保守区引物和FAM标记的非突变探针为如下产品：

试验代码为 Hs03922281_s1，

登记号： 4426961，

ABI产品。

2.一种权利要求1所述的检测CDKN2B基因变异的试剂盒在制备CDKN2B基因变异率的定量检测产品中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取CDKN2B基因组DNA作为模板；

（2）向反应体系中加入PCR预混合液：权利要求1所述的一对靶基因特异性引物和两条不同荧光标记的探针和DNA模板进行定量PCR；

（3）检测步骤（2）突变区和非突变区的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数，作为CT值；

（4）根据步骤（3）突变区和非突变区CT值计算变异系数，即变异系数（%）= 突变区CT值/非突变区CT值x 100。

3.根据权利要求2所述的应用，其中，步骤（1）DNA的提取采用DNeasy血液和组织试剂盒，按照说明书指引提取血液或组织DNA，鉴定DNA浓度和质量，-20℃存储备用。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（2）向反应条件为i）、50℃，2 分钟；ii）、95℃，10 分钟；iii）、95℃，15 秒；iv）、59℃ ， 1分钟；其中iii）和iv）进行 45个循环。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的PCR预混合液为2 x Master mix。

6.根据权利要求2所述的应用，包括以下步骤：

（1）提取CDKN2B基因组DNA，用DNeasy血液和组织试剂盒，按照说明书指引提取血液或组织DNA；

（2）定量PCR：

反应体系：

PCR预混合液选用2 x Master mix: 20ul

引物-M F 50nM: 0.5ul

引物-M R 50nM: 0.5ul

探针-MP 250nM: 0.5ul

Hs03922281_s1: 1.0ul

模板 DNA 10-20ng/ml: 10ul

水: 7.5ul

总反应体积=40ul

反应条件为：i）、50℃，2 分钟；ii）、95℃，10 分钟；iii）、95℃，15 秒；iv）、59℃ ， 1分钟；其中iii）和iv）进行 45个循环；

（3）检测结果：变异系数（%）= 突变CT值/非突变CT值x100。