[发明专利]用于基因组编辑的药物诱导型融合蛋白及其编码基因与应用

说明书

本发明涉及分子生物学领域，具体公开了一种用于基因组编辑的药物诱导型融合蛋白及其编码基因与应用。所述融合蛋白由TALE、核酸酶N和2‑5个串联的ER^T2融合而成，所述TALE连接在ER^T2的C端，所述核酸酶N连接在TALE的C端，即(ER^T2)n‑TALEN。本发明利用2‑5个串联的ER^T2和TALEN的融合开发并优化了一系列药物诱导系统。通过将带有不同功能结构域的TALEN与2‑5个串联的ER^T2相融合，实现了严格有效的药物诱导的基因组编辑，可为潜在的目的基因组位点的基因功能的动态调控提供简单而多样化的技术基础。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种药物诱导型基因组编辑系统。

背景技术

从靶向基因组编辑到转录调控，TALE蛋白已被广泛应用于不同领域。Tal蛋白包括一系列的重复区域，每个重复区域包含33-34个氨基酸。中间重复可变的双氨基酸序列区域(repeat variable diresidues，RVDs)决定了最先结合的碱基。简单的一对一的“Tal密码”连接在一起决定了Tal阵列与DNA结合的特异性，因此当TAL与基因或表观调控相关的效应因子融合时，可以靶向到特定基因位点发挥作用。

当TAL与核酸酶如Fork1连接时，TALENs可以产生双链断裂缺口，进而通过易错非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)或精确地同源修复(homologydirected repair，HDR)实现对基因的编辑。当TALE与转录激活结构域(activator domain，AD)如VP64融合时，靶向启动子序列的Tal阵列可以介导特异性地基因转录激活。许多生物过程是受到高度动态的分子反应来调控的。因此，为了更精确的理解这些过程，条件的和可诱导的调控系统显得尤为必要。现阶段一种广泛应用的药物诱导技术是通过配体结合激发雌激素受体蛋白(ER)从细胞质到细胞核的转运过程(Metzger，D.，Clifford，J.，Chiba，H.&Chambon，P.Conditional site-specific recombination in mammalian cells using aligand-dependent chimeric Cre recombinase.Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America92，6991-6995，1995)。在没有激素配体的情况下，ER与热激蛋白(hsp90)结合定位于细胞质中。一旦配体与ER结合，ER与hsp90解离，并转运到细胞核中。

ER^T2是一种带有三个氨基酸突变G400V/M543A/L544A的人为突变体，与ER相比，其对合成的雌激拮抗剂(4-OHT)更为敏感，并且不会与内源的ER配体β-雌二醇结合，这一特性对降低背景活性是至关重要的(Feil，R.，Wagner，J.，Metzger，D.&Chambon，P.Regulationof Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-bindingdomains.Biochemical and biophysical research communications237，752-757，1997)。ER^T2与Cre重组酶的融合已经被广泛应用到条件性和可诱导的基因组工程中，这一应用有利于研究者从时空顺序上更精确地解析分子功能。