[发明专利]一种杂交海马及其亲本的鉴定引物和鉴定方法

权利要求书

1.一种杂交海马及其亲本的鉴定引物，其特征在于，所述的鉴定引物如下所示：

针对海马核基因Rag1：

Rag1F：5’-GAAGCGGACCACGAGTCACT-3’；

Rag1R：5’-ACAGTTTGTTCGCCGACTCG-3’；

和针对海马线粒体基因Cytb：

CytbF：5’-CTACCTGCACCATCAAACATCTC-3’；

CytbR：5’-CGAAAGGTAAGTCCTCGTTG-3’。

2.一种杂交海马及其亲本的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测海马的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的针对海马核基因Rag1的鉴定引物Rag1F和Rag1R进行PCR扩增；

2)将步骤1)扩增得到的PCR产物进行测序，若所得序列中无单核苷酸杂合位点，则可断定待测海马为纯种的海马个体；若所得序列中存在单核苷酸杂合位点，将PCR产物进行纯化，将纯化后的PCR产物连接到载体中，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆子进行测序，获得两种海马核基因Rag1等位基因的序列；

4)分别将步骤2)获得的两种海马核基因Rag1的等位基因序列在NCBI数据库上进行同源性比对，若两种海马核基因Rag1的等位基因序列与同一种海马的同源性最高，则该待测海马为纯种的海马个体；若两种海马核基因Rag1的等位基因序列分别与两种海马的同源性最高，则该待测海马为这两种海马的杂交个体；

5)当待测海马为杂交海马时，以步骤1)提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的针对海马线粒体基因Cytb的鉴定引物CytbF和CytbR进行PCR扩增，将扩增得到的PCR产物进行测序，获得该杂交海马线粒体基因Cytb的基因序列；

6)将步骤5)所得到线粒体基因Cytb的基因序列在NCBI数据库上进行同源性比对，与其同源性最高的海马种类则为该杂交海马的母本，推断另一种海马则为该杂交海马的父本。

3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，步骤1)和5)所述的PCR扩增，其反应体系均为：25μL，包括基因组DNA 50ng，10×PCR缓冲液2.5μL，25mM MgCl₂ 2μL，5U/μLTaq DNA聚合酶0.2μL，10mM dNTPs 0.5μL，10μM正反向引物各0.5μL，余量为ddH₂O。

4.根据权利要求2或3所述的鉴定方法，其特征在于，步骤1)所述的PCR扩增，其反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性20s，52℃退火20s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，最后12℃保存。

5.根据权利要求2或3所述的鉴定方法，其特征在于，步骤5)所述的PCR扩增，其反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，最后12℃保存。

6.权利要求1所述的杂交海马及其亲本的鉴定引物在鉴定杂交海马及其亲本中的应用。