[发明专利]一种杂交海马及其亲本的鉴定引物和鉴定方法

说明书

本发明公开了一种杂交海马及其亲本的鉴定引物和鉴定方法。本发明结合海马核基因Ra g1和线粒体基因Cytb，设计并合成这两个基因的通用引物，并借助NCBI中NR库收录的海马相关序列的信息，建立了杂交海马及其亲本的鉴定方法，可快速、准确鉴定杂交海马及其父母本来源，从而为海马的选育及开发利用提供参考依据。

技术领域：

本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及一种杂交海马及其亲本的鉴定引物和鉴定方法。

背景技术：

海马(Hippocampus)隶属于海龙科，海马属(Synagnathidae：Hippocampus)，是国家二级保护动物，国际濒危动物保护组织特定保护鱼类(CITES,2004)，广泛分布于热带或亚热带的浅海海域，具有极高的经济价值，在我国素有南方人参之称。在全球范围内，海马资源分布不均，但主要分布在热带或亚热带的浅海中，如澳大利亚和新西兰附近海域、东南亚海域和美洲东部沿海等都是重要的海马栖息地。在已经报道的33种海马中，东南亚海域已经发现27种；马来西亚、印度尼西亚群岛、菲律宾以及中国的南沙群岛非常可能是目前国际海马种类最多、数量最大的海域；而该海域由于季风、洋流等自然条件复杂，海马的种类鉴定及其系统进化一直是系统分类中的难题。

目前，海马资源的最大威胁来自于传统中药的冲击，由于过度捕捞和沿海海域污染等原因，野生海马资源濒临枯竭。海马养殖业的兴起在一定程度上缓解了对野生海马资源的捕捞压力。海马种间亲缘关系较近，容易出现杂交现象。由于杂交海马容易建立品系更为优良的海马，种间杂交的方法已被广泛的应用。

但由于杂交海马通常同时具有两种亲本的形态特征，非常容易造成混淆，单纯从形态上鉴定杂交海马极其困难，因此本应用通过借助分子检测手段解决杂交海马的鉴定问题。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种杂交海马及其亲本的鉴定引物和鉴定方法。

本发明的第一个目的是提供一种杂交海马及其亲本的鉴定引物，所述的鉴定引物如下所示：

针对海马核基因Rag1：

Rag1F：5’-GAAGCGGACCACGAGTCACT-3’(如SEQ ID NO.1所示)；

Rag1R：5’-ACAGTTTGTTCGCCGACTCG-3’(如SEQ ID NO.2所示)；

针对海马线粒体基因Cytb：

CytbF：5’-CTACCTGCACCATCAAACATCTC-3’(如SEQ ID NO.3所示)；

CytbR：5’-CGAAAGGTAAGTCCTCGTTG-3’(如SEQ ID NO.4所示)。

本发明的第二个目的是提供一种杂交海马及其亲本的鉴定方法，包括以下步骤：

1)提取待测海马的基因组DNA为模板，利用上述的针对海马核基因Rag1的鉴定引物Rag1F和Rag1R进行PCR扩增；

2)将步骤1)扩增得到的PCR产物进行测序，若所得序列中无单核苷酸杂合位点，则可断定待测海马为纯种的海马个体；若所得序列中存在单核苷酸杂合位点，将PCR产物进行纯化，将纯化后的PCR产物连接到载体中，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆子进行测序，获得两种海马核基因Rag1等位基因的序列；

4)分别将步骤2)获得的两种海马核基因Rag1的等位基因序列在NCBI数据库上进行同源性比对，若两种海马核基因Rag1的等位基因序列与同一种海马的同源性最高，则该待测海马为纯种的海马个体；若两种海马核基因Rag1的等位基因序列分别与两种海马的同源性最高，则该待测海马为这两种海马的杂交个体；