[发明专利]用于蜡样芽孢杆菌的检测试剂盒、检测方法及应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体公开一种用于蜡样芽孢杆菌的检测试剂盒、检测方法及应用，所述检测试剂盒用于实时荧光RPA检测蜡样芽孢杆菌，包括基于蜡样芽孢杆菌16sRNA基因序列的一对引物和一条探针。所述检测方法具有优异的特异性和灵敏度，检测限为1.0×10^‑3ng/μL，当污染量≥1.5×10⁴CFU/g时，实时荧光RPA即可检出蜡样芽孢杆菌，所需要时间仅为6‑13 min。因此本发明建立的实时荧光RPA能快捷、高效、灵敏的检测蜡样芽孢杆菌，为食品加工质量控制及食源性疫病等公共卫生事件中蜡样芽孢杆菌的检测提供了可借鉴的技术手段。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于蜡样芽孢杆菌的检测试剂盒、检测方法及应用。

背景技术

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)作为一种机会性致病菌，是食物中毒的主要原因之一，能够引起以恶心、呕吐、腹痛及腹泻为主要特征的临床症状。该菌广泛分布于土壤、污水和空气中，在各类生或熟的动植物食品中也常见。蜡样芽孢杆菌具有代谢通路多样化的特点，在不同的环境中具备生态学适应性及强大的生存能力，可以抵抗不利因素，更好地传播。食品由于加工不规范或存放不当极易污染蜡样芽孢杆菌，污染的蜡样芽孢杆菌或残存的芽孢生长繁殖后，因污染的食物外观及性状无明显变化而被误食，从而导致食物中毒。蜡样芽孢杆菌中毒的发病率较高，可达60-100％。因此，建立简便、快速的检测蜡样芽孢杆菌的方法成为研究该菌检测方法的热点。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)是2006年首次报道的核酸扩增技术，因其操作简单、反应快速的特点，在医疗诊断、食源性致病菌、转基因食品和动物疫病检测中受到广泛关注。RPA技术主要依赖于重组酶、单链结合蛋白和具有链置换活性的DNA聚合酶在恒温条件下(25-42℃)进行，而real-time RPA技术将RPA基础反应与荧光探针结合，具备了实时监测扩增进程的优势，灵敏度和特异性也进一步提高，已被广泛运用于细菌、病毒及寄生虫的检测。

目前已报道的蜡样芽孢杆菌检测方法有分离培养法、普通PCR、多重PCR、荧光PCR、LAMP及基因芯片等，但是分离培养法和基因芯片技术操作繁琐，检测时间相对较长；PCR技术不仅对环境要求高，而且需要昂贵的PCR仪器和熟练的技术人员。上述方法在突发食物中毒等公共卫生事件中的应用存在有诸多不便。LAMP方法属于等温检测方法，但LAMP反应温度较高，高于60℃，而且反应时间较长，一般在30-60min之间。

发明内容

针对现有蜡样芽孢杆菌检测方法操作繁琐、检测时间长，成本高等问题，本发明提供一种用于蜡样芽孢杆菌的检测试剂盒。

进一步地，本发明还提供用于蜡样芽孢杆菌的检测方法及其应用。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

本发明发明人通过对于GeneBank中蜡样芽孢杆菌的16sRNA基因序列(登录号：KY224970.1)进行分析，选择保守区域，设计实时荧光RPA即real-time RPA引物及exo探针，目的片段大小为297bp。

一种蜡样芽孢杆菌的检测试剂盒，所述检测试剂盒用于实时荧光RPA检测蜡样芽孢杆菌，包括基于蜡样芽孢杆菌16sRNA基因序列的一对引物和一条探针，

其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：

上游引物：5'-ATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAG-3'

下游引物：5'-CAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCA-3'

探针：5'-CTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGC-FAM-dT-THF-