[发明专利]用电穿孔向细胞负载抗原

说明书

本申请是申请日为2006年9月1日、申请人为麦克斯塞特公司、发明名称为“用电穿孔向细胞负载抗原”的中国专利申请200680041193.9的分案申请。

本发明要求2005年9月2日提交的美国专利申请号11/219,307的优先权，该申请经引用在此全文并入。

技术领域

本发明一般涉及细胞生物学，微生物学，癌症生物学，以及免疫学领域。更具体地，本发明关注的是涉及用电穿孔法向抗原提呈细胞负载一个或多个抗原的方法，以及经负载的抗原提呈细胞的组合物。用于本发明中的抗原包括过度增殖细胞，受微生物感染的细胞，或微生物。本发明还关注对治疗对象使用负载了一个或多个过度增殖细胞，受微生物感染的细胞，或微生物的抗原提呈细胞来治疗和预防疾病如癌症或任何其他传染性疾病的方法。

背景技术

对外来抗原和肿瘤相关的抗原(TAA)的免疫响应通常始于免疫系统中最为有效的抗原提呈细胞--树突状细胞(dendritic cell，DC)对抗原的摄取。树突状细胞(DC)代表着体内功能最强的的抗原提呈细胞类型(APC)，能够吞噬外来抗原并将它们提呈给初始和记忆T细胞(Van Schooten等,1997；Mellman and Steinman,2001)。其他类型的APC包括巨噬细胞和B细胞。

树突状细胞(DC)一般通过微胞饮作用和/或吞噬作用来摄取抗原，然后，它们在细胞内对抗原进行处理，并随后将抗原提呈给免疫系统的T细胞。尽管这个过程通常在体内发生，但也可以将DC移出体内，在活体外进行培养，在活体外向这些培养的树突状细胞提供抗原，然后使这些细胞回到体内，在此它们可以与T细胞相互作用而引发对兴趣抗原的增强的免疫响应。这种将抗原提供给DC的方法通常被称作“冲击”或共培养，一般通过将抗原加到DC上并使DC对抗原进行微胞饮和/或吞噬就能实现。在活体外的DC和抗原的混合物增加了DC对抗原的微胞饮和/或吞噬的机会，并克服了活体内环境下的低效率。使用这种“共培养”而将肿瘤抗原提供给DC在Schnurr等,2002；Herr等,2000；Geiger等,2001中进行了描述。

纯化的与肿瘤相关的抗原已对一些肿瘤进行了表征并在用作癌症疫苗上获得了一定的成功(等,2002；Asavaroengchai等,2002)。然而，对肿瘤相关的抗原(TAA)的辨认仍然有限。此外，对纯化的和表征过的TAA的使用并不是对所有的癌症都可行。在TAAs是已知的并被纯化和负载进DC的情况下，一种更有效的负载方法将降低所需的抗原量。因此，人们对鉴别出一种可更有效地将TAA提呈给APC的方法产生了极大的兴趣。

电穿孔被描述为一种将非渗透的分子引入活细胞中的手段(Mir,2000中综述)。还不能在整个细胞水平上完全理解细胞暴露于电脉冲的后果。在外电场存在下，认为在横跨膜电势差上产生了改变(Neumann等,1999；Weaver and Chizmadzhev,1996；Kakorin等,1996)。该电场叠加于静息横跨膜电势差上，并可由麦克斯韦等式在几个近似下(厚度大大降低的细胞膜，零细胞膜导电率等)计算得出(Mir,2000)。这些在横跨膜电势差上的改变已在实验中观察到(Hibino等,1993；Gabriel and Teissi é,1999)。细胞暴露于电脉冲的影响在悬浮液中孤立的细胞中得到了很好地分析描述(Kotnik等,1998)。

在分子水平的分析中，对在细胞膜水平产生的现象的解释是假设的。假设在达到净横跨膜电势阀值之上时，膜结构的变化将足以使膜对于具有给定物理化学特性(分子量，半径等)的本不可渗透的分子变得易于渗透(参见Mir,2000)。

电穿孔最常用于将DNA(Knutson and Yee,1987)和RNA(Van Meirvenne等,2002；Van Tendeloo等,2001)引入细胞中。它被描述为一种可能够将其他大分子引入活细胞包括抗原提呈细胞的细胞质中的方法(Zhou等,1995；Harding,1992；Chen等,1993；Li等,1994；Kim等,2002)。

然而，在将电穿孔用于治疗癌症，其他过度增殖疾病或由微生物引起的疾病如感染性疾病时，缺乏有效的方法。具体来说，以前的研究还未描述过使用电穿孔来产生对癌症抗原或其它致病抗原，特别是对未表征的抗原产生免疫响应的方法。发展这类技术将给癌症疗法和其他疫苗方面带来极大的进展。

发明内容