[发明专利]一种敲除AAV受体的方法、敲除了AAV受体的HEK293细胞株及其应用有效
| 申请号： | 201710553164.0 | 申请日： | 2017-07-07 |
| 公开（公告）号： | CN107245475B | 公开（公告）日： | 2019-07-16 |
| 发明（设计）人： | 李华鹏 | 申请（专利权）人： | 广州派真生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/85;C12N15/90;C12N7/00;C12R1/93 |
| 代理公司： | 广州容大专利代理事务所(普通合伙) 44326 | 代理人： | 刘新年 |
| 地址： | 511370 广东省广州市高新技术*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 aav 受体 方法 除了 hek293 细胞株 及其 应用 | ||
【权利要求书】：
1.一种利用敲除了AAV受体的HEK293细胞株制备AAV的方法，其特征在于，操作步骤包括：
(1)铺敲除了AAV受体的HEK293细胞株至反应孔板中；
(2)将pRC-DJ载体、Ad辅助载体及AAV-EGFP载体加入DMEM中，再加入PEI，马上混匀，培养；
(3)培养72小时后收集细胞和上清，反复冻融三次，离心得上清即为AAV粗提液；其中，所述HEK293细胞株敲除的是KIAA0319L基因第4个外显子或第8个外显子。
2.根据权利要求1所述的利用敲除了AAV受体的HEK293细胞株制备AAV的方法，其特征在于，具体操作步骤包括：
(1)铺敲除了AAV受体的HEK293细胞株约3x105至24孔板中；
(2)用pRC-DJ载体、Ad辅助载体及AAV-EGFP载体各0.2～2ug，加入0.5ml DMEM中，再加入PEI15ul，马上混匀，常温下放置10分钟后加入细胞培养基中再放回37度细胞培养箱5％CO2浓度条件下培养；
(3)培养72小时后收集细胞和上清，反复冻融三次，10000g离心10分钟后上清为AAV粗提液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中反复冻融操作为37℃水浴和干冰-乙醇浴中反复冻融，解冻与冻结每次各2分钟。
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