[发明专利]一种敲除AAV受体的方法、敲除了AAV受体的HEK293细胞株及其应用

说明书

本发明涉及基因工程和细胞学领域，具体涉及一种AAV受体敲除方法、敲除AAV受体的HEK293细胞株及其应用；所述被敲除的AAV受体为KIAA0319L；所述敲除方法包括：构建靶向AAVR基因组序列的sgRNA载体；转染293T细胞，培养得到各克隆细胞；Surveyor基因突变分析试验；选出AAVR突变的单克隆；再选择出高产AAV的AAVR突变细胞株；鉴定其它潜在突变位点的突变情况；把无其它突变位点的细胞株再扩大，建库以备生产。本发明的被敲除的AAV受体的HEK293细胞株生产AAV的最终产量比常规HEK293产量高出约50％。

技术领域

本发明涉及基因工程和细胞学领域，具体涉及一种敲除AAV受体的方法、敲除了AAV受体的HEK293细胞株及其应用。

背景技术

目前基因治疗从近几十年来无数科学家的梦想正逐步变成了现实。基因治疗的载体一直是整个基因治疗的关键，作为基因载体，需要具有安全性、有效性、特异性。多种病毒、非病毒载体经过多年的演变、淘汰，目前重组腺相关病毒(rAAV)载体是公认为符合以上三个标准的基因治疗载体。由于AAV的生产得率长期以来提升缓慢，因而临床应用的普及程度也受此制约。随着近几年来第一个被欧盟批准的治疗脂肪酸酶缺陷的基因治疗药物Glybera上市，Spark Theraputics公司的治疗先天性失明的SPK-RPE65三期临床表现优秀，AAV作为基因治疗载体的方向与道路已完全被证明，但AAV的生产效率仍是基因治疗的关键瓶颈。一个需要全身性转导的遗传疾病需要约1x10¹⁵AAV基因组拷贝数(GC)的颗粒，而这个临床级别的生产量需要50万美元。生产上，如果用目前实验室能力范围内一次50个15cm盘可获得1x10¹³GC的生产效率来计算，则需要要生产100次或100倍的生产规模才能得到治疗一个病人的总量。

目前AAV的主流生产方法是三质粒转染HEK293细胞方法。三质粒转染法简单、快速，但由于HEK293为贴壁细胞，这种方法在规模上的扩展较有困难。但如果能把贴壁细胞驯化为悬浮细胞，则该方法会打破自身的局限，成为规模化工业生产的重要候选方案。把贴壁的HEK293细胞驯化为悬浮细胞近几年已有人取得成功，但由于原本的生产效率仍是未能满足需求，因此规模化生产只能靠单一地增加生产规模。

在常规的AAV生产中，已有多篇报道发现了在大部分AAV在HEK293细胞生产AAV过程中分泌到上清中。这一现象使目前的AAV生产方法有了一定的变化，即不再忽略上清中存在的AAV；并且还产生了一个新的AAV生产方式：长时间培养三质粒转染后的HEK293细胞，并连续地收集上清中的AAV。这一方法据称可达到原先一次转染后三天收获AAV的总量的5倍。但是，上清中的AAV是由HEK293细胞分泌出来，也会因为AAV容易感染HEK293细胞而再次进入HEK293细胞中。感染进入HEK293细胞后的AAV会经历溶酶体的包含、消化外壳、AAV基因组逃脱溶酶体等步骤，最终会导致已经生产、分泌出来的AAV再次被回收，总AAV产量变低。

由此可见，现有技术生产AAV的产量瓶颈亟待打破，在方法上改进、创新，取得更高的AAV产率是目前基因治疗的一大亟待改善的问题。

发明内容

有鉴于此，有必要针对的问题，提供一种敲除AAV受体的方法、敲除了AAV受体的HEK293细胞株及其应用，可将AAV感染HEK293细胞这一途径阻断，提升AAV的最终产量。

本发明通过以下技术方案实现：