[发明专利]一种药物诱导的基因转录激活方法

说明书

本发明涉及分子生物学领域，具体公开了一种药物诱导的基因转录激活方法。通过转染(ER^T2)n‑TALE‑ADs系统或共转染HIT TALE‑SunTag体系至细胞质内，在特定需要的时间利用4‑OHT和/或TAM和/或他们的衍生物进行药物诱导，实现特定基因的转录激活；所述(ER^T2)n‑TALE‑ADs系统为可表达(ER^T2)n‑TALE‑ADs融合蛋白的载体；所述HIT TALE‑SunTag体系为可分别表达融合蛋白(1)与融合蛋白(2)中的一种或多种的载体组合：(1)NLS‑TALE‑GCN4或ER^T2‑TALE‑GCN4或(ER^T2)n‑TALE‑GCN4，(2)ScFv‑ER^T2‑ADs或ScFv‑(ER^T2)n‑ADs。本发明基于ER^T2的融合实现了4‑OHT诱导的TALE转录激活体系。该体系有助于对动态生物学过程进行有效地精确地控制，对于生物医药的研究和开发应用也有很大的价值。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种药物诱导的基因转录激活方法。

背景技术

从靶向基因组编辑到转录调控，TALE蛋白以被广泛应用于不同领域。Tal蛋白包括一系列的重复区域，每个重复区域包含33-34个氨基酸。中间重复可变的双氨基酸序列区域(repeat variable diresidues，RVDs)决定了最先结合的碱基。简单的一对一的“Tal密码”连接在一起决定了Tal阵列与DNA结合的特异性，因此当TAL与基因或表观调控相关的效应因子融合时，可以靶向到特定基因位点发挥作用。例如，当TALE与转录激活结构域(activator domain，AD)如VP64融合时，靶向启动子序列的Tal阵列可以介导特异性地基因转录激活。

许多生物过程是受到高度动态的分子反应来调控的。因此，为了更精确的理解这些过程，条件的和可诱导的调控系统显得尤为必要。现阶段一种广泛应用的药物诱导技术是通过配体结合激发雌激素受体蛋白(Estrogen Receptor，ER)从细胞质到细胞核的转运过程(Metzger，D.，Clifford，J.，Chiba，H.Chambon，P.Conditional site-specificrecombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Crerecombinase.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America92，6991-6995，1995)。在没有激素配体的情况下，ER与热激蛋白(hsp90)结合定位于细胞质中。一旦配体与ER结合，ER与hsp90解离，并转运到细胞核中。

ER^T2是一种带有三个氨基酸突变G400V/M543A/L544A的人为突变体，与ER相比，其对合成的雌激素拮抗剂4-羟基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen，4-OHT)更为敏感，并且不会与内源的ER配体β-雌二醇结合，这一特性对降低背景活性是至关重要的(Feil，R.，Wagner，J.，Metzger，D.Chambon，P.Regulation of Cre recombinase activity by mutatedestrogen receptor ligand-binding domains.Biochemical and biophysical researchcommunications237，752-757，1997)。ER^T2与Cre重组酶的融合已经被广泛应用到条件性和可诱导的基因组工程中，这一应用有利于研究者从时空顺序上更精确地解析分子功能。

目前，利用TALE实现药物诱导的转录激活方面的研究已有一些成功的报道，但在应用上具有一定的局限性。转录水平的调控方式通常应答速度较慢，且组织特异性启动子的选择相对较少，相比之下，针对翻译后蛋白活性的调节可能是更为理想的方式。

发明内容