[发明专利]用于基因转录激活的药物诱导型CRISPR/Cas9系统

说明书

本发明涉及分子生物学领域，具体公开了用于基因转录激活的药物诱导型CRISPR/Cas9系统。所述药物诱导型CRISPR/Cas9系统包括靶向特定基因位点的16‑22nt sgRNA和如下(一)～(三)中的任意一种载体/载体组合：(一)表达融合蛋白dCas9‑(ER^T2)n‑ADs或dCas9‑ADs‑(ER^T2)n的载体；(二)表达融合蛋白dCas9‑(NLS)m或dCas9‑(ER^T2)n和MCP‑(ER^T2)n‑ADs的载体组合；(三)表达融合蛋白dCas9‑(NLS)m‑(GCN4)p和scFv‑(ER^T2)n‑ADs的载体组合。经实验研究发现，相对于现有技术，本发明所述系统能够更加有效的实现药物诱导对基因转录激活的调控作用，操作更为灵活方便，且保持较低的背景活性。有助于对动态生物学过程进行有效精确的控制，对于生物医药的研究和开发应用也有很大的价值。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及用于基因转录激活的药物诱导型CRISPR/Cas9系统。

背景技术

CRISPR/Cas9系统，源自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。利用RNA介导的DNA结合活性和核酸内切酶活性，该系统可通过一种序列依赖的方式在基因组中进行调节。Cas9蛋白以序列特异性的方法结合并切割双链DNA，而这种序列特异性的结合是通过与靶序列互补的guide RNA(gRNA)及邻近的protospacer-adjacent motif(PAM)实现的。Cas9与gRNA形成的复合物介导DNA双链断裂，同样是通过NHEJ和HDR两种DNA修复机制完成靶向基因的编辑。CRISPR/Cas9系统也可与不同的效应分子结合而扩展其功能，使之具有转录激活、抑制、基因组DNA标记或表观调节等能力。为此，Cas9蛋白被进一步改造，将核酸酶功能域发生突变而产生丧失活性的dead Cas9(dCas9)形式，同时仍保留与DNA结合的活性便于募集相应的效应分子到靶位点而发挥作用。

随着人们对CRISPR/Cas9认识的不断增加，这项技术已被广泛应用于生物学研究的各个领域。然而，对于动态的生物学系统的研究常常需要更加精确的调控方式，建立药物诱导的CRISPR/Cas9系统，实现效应蛋白功能随时开关以满足实际应用需求是人们追求的重要目标之一。一个可能的方案是使Cas9蛋白的表达受药物诱导型启动子或是组织特异性启动子调控，通过控制效应蛋白的转录来控制基因组编辑或转录的发生。这种方案的缺点在于效应蛋白需要经过转录翻译的过程才能具备活性，对药物诱导的应答时间通常较慢，且操作方法可能比较繁琐，体内应用存在一定障碍。