[发明专利]一种从Bt发酵液中分离纯化琥珀酸的方法

权利要求书

1.一种从Bt发酵液中分离纯化琥珀酸的方法，其特征在于整套方法由八个串联步骤组成，这八个步骤有先后次序，且缺一不可；包括(1)Al₂O₃去絮凝沉淀物；(2)无水乙醇去醇不溶性沉淀物；(3)石油醚去除醚溶性上清物；(4)非极性大孔树脂对琥珀酸吸附；(5)无水乙醇萃取，加水浓缩去乙醇，冷冻干燥；(6)乙醚萃取，加水浓缩去乙醚，冷冻干燥；(7)使用Agilent Zorbax SB-C18型号的9.4×250mm×5μm色谱柱半制备；(8)使用Agela VenusilASB-C18型号的4.6×150mm×5μm色谱柱半制备，琥珀酸纯度在95％以上；

具体步骤为：

(一)去除苏云金芽胞杆菌Bt发酵液中的杂质

(1)去除絮凝沉淀物；取10L初始发酵液，按照1％的浓度加入Al₂O₃，充分搅拌后置于4℃冰箱静止12小时，取出后8000r/min离心10min，收集上清，用1mol/L的HCl调至pH4.0，50℃真空浓缩，真空度-0.095至-0.088Mpa范围，浓缩至200mL备用；

(2)去除醇不溶性沉淀物；取步骤(1)所制得的备用液体200ml，加入200mL无水乙醇，静置1小时后再次离心，8000r/min离心10min，取上清备用；

(3)去除醚溶性上清物；取步骤(2)所制得的备用液体，用等体积的石油醚萃取，反复3次，收集下层相，即得抗生素粗提液，保存于4℃冰箱备用；

(二)样品的粗制

(4)取非极性大孔树脂，按树脂重量与步骤(3)所制得的备用粗提液体积1:2的比例混合上样，湿法装柱，装入量的高度40cm，室温静态吸附2-3小时，先用去离子水洗脱4-6BV，1BV为1倍柱体积，洗脱液为未吸附相，洗脱流速约0.5mL/min，收集洗脱液，减压浓缩后用去离子水定容至原体积；

(三)样品的精制

(5)取步骤(4)所制得的液体200ml，使用冷冻干燥机，将样品冻干，加入400ml无水乙醇萃取，取上清液使用0.45μm有机系滤膜过滤后，加水并减压蒸馏除去乙醇，体积浓缩至50ml，再次使用冻干机冻干样品；

(6)使用步骤(5)同样的方法，加入乙醚萃取，上清液过滤后减压蒸馏，并加水除去乙醚，得到精制品；

(四)高效液相半制备琥珀酸

(7)第一次半制备；取步骤(6)所制得的液体，使用Agilent Zorbax SB-C18型号的9.4×250mm×5μm色谱柱，流动相为甲醇、超纯水，柱温35℃，紫外波长为210nm，流速为2ml/min；洗脱方法为：

0-10min：甲醇:超纯水＝5:95；

10-15min：甲醇:超纯水＝5:95梯度变为甲醇:超纯水＝80:20；

15-25min：甲醇:超纯水＝80:20；

25-30min：甲醇:超纯水＝80:20梯度变为甲醇:超纯水＝5:95；

30-35min：甲醇:超纯水＝5:95；

多次收集6.5-7.5min组分，减压蒸馏除去甲醇，样品冷藏备用；

(8)第二次半制备；取步骤(7)所制得的备用液体，使用Agela VenusilASB-C18型号的4.6×150mm×5μm色谱柱，流动相为甲醇、超纯水，柱温35℃，紫外波长为210nm，流速为1ml/min，洗脱方法为:

0-10min：甲醇:超纯水＝0.2:99.8；

多次收集4-5min时间段组分，减压蒸馏除去甲醇，即得到了高纯度琥珀酸；

依据上述方法，能够将琥珀酸从Bt发酵液中分离纯化出来，且纯度高。