[发明专利]一种从Bt发酵液中分离纯化琥珀酸的方法

说明书

本专利公开了一种从Bt发酵液中分离纯化琥珀酸的方法。该方法包括八个步骤：(1)加入Al₂O₃絮凝法去除沉淀杂质；(2)加入乙醇去除沉淀杂质；(3)加入石油醚萃取除去上清杂质；(4)使用大孔树脂柱吸附粗制，解吸附；(5)无水乙醇萃取，加水浓缩去乙醇，冷冻干燥；(6)乙醚萃取，加水浓缩去乙醚，冷冻干燥；(7)使用使用Agilent Zorbax SB‑C18(9.4×250mm×5μm)色谱柱；(8)使用Agela Venusil ASB‑C18(4.6×150mm×5μm)色谱柱。两次高效液相半制备，获得较高纯度琥珀酸，纯度在95％以上。

技术领域

本发明属于分析化学、有机化学、生物化学领域。具体涉及的是从Bt发酵液中分离纯化琥珀酸的方法。

背景技术

琥珀酸，琥珀酸学名为丁二酸。分子量为118.09，无色结晶体，味酸，可燃。有二种晶形，相对密度1.572(25/4℃)。溶解特性：1g溶于13ml冷水、1ml沸水、18.5ml乙醇、6.3ml甲醇、36ml丙酮、20ml甘油和11ml乙醚，几乎不溶于苯、二硫化碳、四氯化碳和石油醚。分子结构如下所示：

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)发酵液的上清对草生欧文氏杆菌有明显的抑菌作用，经过分离纯化、核磁和质谱分析确定该抑菌物质为琥珀酸。发酵液的上清对草生欧文氏杆菌抑菌特性表明，与某些Bt菌株发酵所生物合成的Zwittermicin A(简写ZwA)特性相似。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)晶体蛋白对害虫具有毒杀性、同时对人类健康不构成危害，这一点已经被世界认可。一方面，Bt菌剂在外源上防治虫害；另一方面，该杀虫蛋白基因已经被广泛地用于转基因植物，从内源上控制虫害。无论哪种形式，由于害虫不断地进化，导致某些害虫对某特定基因型的杀虫蛋白逐渐表现出抗性，杀虫效果逐渐失去意义。解决该问题最好的方法是找到某种物质，提高杀虫蛋白的毒力活性。Bt中的Zwittermicin A(简写ZwA)拥有这个特性。张小朋等(2006)以相同的草生欧文氏杆菌为指示菌，利用来自于蜡状芽胞杆菌(B.cereus Bc)编号UW85的菌株发酵，获得了ZwA，并建立了对ZwA的检测方法和标准曲线。在其随后的研究中发现，ZwA协同晶体蛋白提高了对棉铃虫害虫和甜菜夜蛾害虫的药效。

参考文献：张小朋.2006.对甜菜夜蛾高毒力的苏云金芽胞杆菌Dl-23菌株的选育及其发酵优化[D].武汉:华中农业大学博士学位毕业论文.

发明内容

本发明的目的是提供一种从Bt发酵液中分离纯化琥珀酸的方法。

为了实现上述的目的，本发明的发明人进行了辛勤的研究，将琥珀酸从Bt发酵液中分离纯化出来，整套方法由八个串联步骤组成。这八个步骤有先后次序，且缺一不可。包括(1)Al₂O₃去絮凝沉淀物；(2)无水乙醇去醇不溶性沉淀物；(3)石油醚去除醚溶性上清物；(4)非极性大孔树脂对琥珀酸吸附；(5)无水乙醇萃取，加水浓缩去乙醇，冷冻干燥；(6)乙醚萃取，加水浓缩去乙醚，冷冻干燥；(7)使用Agilent Zorbax SB-C18(9.4×250mm×5μm)高效液相色谱柱半制备；(8)使用Agela Venusil ASB-C18(4.6×150mm×5μm)高效液相色谱柱半制备，琥珀酸纯度在95％以上。

具体步骤为：

(一)去除苏云金芽胞杆菌Bt发酵液中的杂质

(1)去除絮凝沉淀物；取10L初始发酵液，按照1％的浓度加入Al₂O₃，充分搅拌后置于4℃冰箱静止12小时，取出后8000r/min离心10min，收集上清。用1mol/L的HCl调至pH4.0，50℃真空浓缩，真空度-0.095至-0.088Mpa范围，浓缩至200mL备用；