[发明专利]一种旱稻孢囊线虫LAMP快速检测方法

权利要求书

1.一种旱稻孢囊线虫LAMP快速检测方法，其特征在于：其中LAMP反应体系所使用的引物是：

1)HE-F3：5’-GCTCTCTGTCCATGTCAGGA-3’，

2)HE-B3：5’-CCGCAACTAGCCCAATGC-3’，

3)HE-FIP：5’-GCAGGACAGCTGCCCATGTGGCGGATCGTTCGGGAGAA-3’，

4)HE-BIP：5’-GCGCAGCTTGGGATGCTTTTACCACAGGCTTACACTTGTG-3’，

5)HE-LB：5’-AGGTTGGAGCTGGGATGCG-3’。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其中的LAMP反应体系包括：

(1)引物混合液：外引物HE-F3和HE-B3各0.2μmol/L，内引物HE-FIP和HE-BIP各1.4μmol/L,环引物HE-LB为0.4μmol/L；

(2)反应混合液：3.2mmol/L dNTP,20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8),10mmol/L KCl,3mmol/L MgSO₄,10mmol/L(NH₄)₂SO₄,0.1％Triton x-100,8U Bst DNA大片段聚合酶；

(3)1μl DNA模板；

加灭菌双蒸馏水补全到25μl。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其中LAMP反应条件如下：将引物混合液和反应混合液混合均匀后加入1μl DNA模板，61～65℃温育30～90min，85℃保温5min。

4.根据权利要求3所述的检测方法，包括LAMP反应后的鉴定步骤，所述鉴定步骤包括显色鉴定或电泳图鉴定。

5.根据权利要求4所述的检测方法，所述显色鉴定为在扩增反应产物中加入的显色剂为100倍SYBR Green I，以肉眼观察显色结果，显绿色荧光的为旱稻孢囊线虫。

6.根据权利要求4所述的检测方法，所述电泳图鉴定为电泳图显示为梯形条带的为旱稻孢囊线虫。

7.根据权利要求4所述的检测方法，所述电泳图鉴定为在扩增反应产物中加入探针，杂交后，插入LFD试纸，发现同时存在测试带和控制带，所述探针的序列为：HE-probe：5’-CGCCGAGGTTGGAGCTGGGATGC-3’。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其中的HE-FIP采用荧光基团标记，5’段采用生物素标记。

9.根据权利要求7所述的检测方法，所述探针5’段采用FITC标记。

10.权利要求1-9所述任一检测方法在旱稻孢囊线虫早期诊断和辅助鉴定中应用。