[发明专利]一种旱稻孢囊线虫LAMP快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种旱稻孢囊线虫LAMP快速检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

旱稻孢囊线虫(Heterodera elachista)是一种主要侵染水稻的植物寄生线虫，最早于日本枥木县的稻田中被发现(Ohshima Y.Heterodera elachista n sp.an upland rice cyst nematode from Japan[J].Japanese Journal of Nematology，1974(4):51-56.)。目前该线虫病害在湖南省多个县(市)丘陵地带的水稻田首次发现(Ding Z，Namphueng J，He X F.First report of the cyst Nematode(Heterodera elachista)on rice in Hunan province,China[J].Plant Disease,2012,96(1):151)。旱稻孢囊线虫一般寄生在寄主根部，其危害症状与水肥失调引起的症状极其相似，除吸收寄主的营养和对植物根部造成伤害外，还降低水稻对水的利用效率，继而影响寄主的生长和发育(丁中,Namphueng Janthathang,何旭峰等.旱稻孢囊线虫生活史及侵染特性[J].中国水稻科学,2012,26(6):746-750)，造成水稻减产7％～19％(Bridge J，Luc M，Plowright R A.Plant Parasitic Nematodes in Tropical and Subtropical Agriculture[M].Wallingford：CAB International,1990:69–108)。目前旱稻孢囊线虫病主要发生在长江中下游水稻种植区，且危害日趋严重，有可能成为我国的水稻生产中的又一严重威胁，同时该线虫病害的发生分布还不十分的明确，对该线虫做出快速准确的鉴定是当前麦类作物生产急需解决的问题。

旱稻孢囊线虫属于Cyperi群组，在形态上与H.oryzae、H.sacchari和H.leuceilyma非常相近。其与H.sacchari和H.leuceilyma最明显的区别是在孢囊细长的下桥上缺乏指形的投影，而与H.oryzae相比，孢囊略小，二龄幼虫长度略短。目前旱稻孢囊线虫的鉴定大部分仍然依赖于传统的形态学鉴定方法，但是由于形态学鉴定耗时、需要很熟练的技术作为基础，并且需要专门从事分类的人员来完成，这些原因使传统的鉴定方法时常存在一定误差并且不适用于大规模的样品检测。

近年来，随着分子生物学的快速发展，PCR等快速检测技术已经广泛的运用到植物线虫的快速检测和鉴定中。目前运用到孢囊线虫的检测技术主要包括ITS-RFLP,PCR，real time PCR等。

Amiri等通过对H.betae、H.ciceri、H.glycines和H.medicaginis、H.schachtii、H.trifolii的ITS序列进行分析，筛选出特异性引物SHF6，将此引物与AB28(或rDNA2)引物结合，构建了甜菜孢囊线虫一步双重PCR的检测方法(Amiri S.,Subbotin S.A.,Moens M.,An efficient method for identification of the Heterodera schachtii sensu stricto group using PCR with specific primers.Nematol.medit.2001,29:241-246)。Subbotin S A,Peng D L,Moens M.运用双重PCR检测大豆孢囊线虫的方法，在一个PCR反应体系中同时运用通用引物D3A和D3B以及特异性引物GlyF1和rDNA2，从52个大豆孢囊线虫群体中均扩增出两个DNA片断(181bp and 345bp)，检测的敏感度高达单个孢囊、单头二龄幼虫的微量DNA(Subboton S.A.,Peng D L,Moens M.,A rapid method for the identification of the soybean cyst nematode Heterodera glycines using duplex PCR.Nematology 2001,vol.3(4):365-371)。