[发明专利]一种制备B区缺失的成熟人凝血因子Ⅷ的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及人凝血因子Ⅷ重链FⅧ_H和轻链FⅧ_L表达载体的构建、哺乳动物细胞的转染、FⅧ_H和FⅧ_L高效表达细胞株的筛选和鉴定、B区缺失的成熟人凝血因子Ⅷ的制备、活性检定及在药学上的应用。

背景技术

血友病是一类由于缺乏某种凝血因子从而致使患者发生凝血功能障碍的疾病，临床上分为三个类型：血友病A、血友病B以及凝血因子XI缺乏症。其中血友病A多见，大概占总数的80％。该类疾病是由于血液中的凝血因子Ⅷ缺乏从而致使患者发生严重凝血障碍，是X 染色体连锁的隐性遗传性疾病。

凝血因子Ⅷ基因在X染色体Xq28处，其基因全长为186kb，该编码序列为当时已知的最大的基因。成熟FⅧ蛋白由三种结构域组成。A结构域：含有三个片段，在氨基端出现两次，为A1、A2，在羧基端出现一次，为A3。每个A片段均约由330个氨基酸组成，有30％的同源性，与血浆铜蓝蛋白同源性颇高。B结构域：只有一个中间片段，约由980个氨基酸组成，是高度糖基化的区域，对FⅧ的合成与分泌、蛋白清除具有重要意义，但其在FⅧ的活化过程被完全清除。C结构域：含有两个片段，在羧基端出现两次，为C1、C2，每个C结构域由约150个氨基酸组成。其排列顺序是A1-A2-B-A3-C1-C2，其中A1-A2-B构成凝血因子Ⅷ的重链(FⅧ_H)，A3-C1-C2构成凝血因子Ⅷ的轻链(FⅧ_L)。

自1984年成功克隆FⅧ的cDNA以来，人FⅧ的重组表达就成为研究的热点。1989年第一次报道使用重组人全长FⅧ(rhFⅧ)制剂成功的治疗了一位严重型A血友病患者的事例。 1992年FDA正式批准第一代野生型全长rhFⅧ应用于血友病A的治疗。2000年拜耳公司研制的新型rhFⅧ药物——拜科奇得到FDA和EMEA的批准可用于治疗血友病A。直到2007 年SFDA才批准该药物能在我国上市，成为国内第一个上市的rhFⅧ产品。但第一代野生型全长rhFⅧ制剂中仍然含有大量血浆来源蛋白质，因而其稳定性、活性及成本等方面不能满足市场的需要。这促使科研工作者努力开发新一代的重组FⅧ制品。

FⅧ的B结构域约占完整分子的40％，该区域的功能还未彻底研究清楚。但自从发现重组表达B结构域缺失的BDD-rFⅧ(B-domain deleted recombinant factorⅧ，BDD-rFⅧ)由于 mRNA长度减少，其转录活性提高了17倍，蛋白表达量和活性明显高于全长rhFⅧ，且研究表明B结构域缺失不影响体内或体外的促凝活性，因此B结构域缺失的rFⅧ成为新一代rhF Ⅷ的重点研究方向。本发明提供了一种制备B区缺失的成熟人凝血因子Ⅷ的方法。

发明内容

本发明的目的是提供两种分别克隆有rhFⅧ_H和rhFⅧ_L基因的载体，利用该载体在哺乳动物细胞系CHO-KⅠSV中高效表达rhFⅧ_H和rhFⅧ_L蛋白；提供了一种制备B区缺失的成熟人凝血因子Ⅷ的方法及其药学应用。

在第一方面，本发明提供了一种获得高效表达rhFⅧ_H和rhFⅧ_L的表达载体的方法。

首先，通过对CHO细胞密码子偏爱性的分析，发现FⅧ_H和FⅧ_L基因中氨基酸密码子的偏爱性与CHO细胞有较大差异，为了提高基因的表达效率，将FⅧ_H和FⅧ_L基因中的氨基酸密码子改造为CHO细胞高偏爱性密码子，通过人工合成的方法获得FⅧ_H和FⅧ_L基因。FⅧ_H(不包含B结构域)基因2220bp(位于FⅧ基因229-2448bp)，FⅧ_L基因2052bp(位于FⅧ基因5173-7224bp)。

将测序正确的FⅧ_H和FⅧ_L依次克隆至真核表达Pklight载体、IRES-EGFP载体和Pee12.4 载体中，然后利用脂质体转染法将重组的真核表达载体转入CHO-KⅠSV细胞，以绿色荧光蛋白(EGFP)作为报告基因，通过谷氨酰胺合成酶(GS)加压和流式细胞仪筛选得到分别稳定表达rhFⅧ_H和rhFⅧ_L蛋白的CHO-KⅠSV细胞系。