[发明专利]一种指示Nrf2‑Keap1相互作用的BiFC细胞内检测方法及系统

权利要求书

1.一种指示Nrf2-Keap1相互作用的BiFC细胞内检测系统，其特征在于，由若干融合蛋白组合构成，所述融合蛋白包括融合有Nrf2和eGFP缺失C末端的N158蛋白、融合有Keap1和eGFP缺失N末端的C159蛋白对应的编码基因片段以及表达载体pEGFP-C1删掉编码GFP的编码片段重组构成的表达载体，所述Nrf2和N158之间以及Keap1和C159之间由linker多肽组成；所述融合蛋白组合：A.Nrf2+linker+N158；B.N158+linker+Nrf2；C.Keap1+linker+C159；D.C159+linker+Keap1；BiFC检测时可以任意将AC、AD、BC、BD其中的一个组合同时转染细胞，进行荧光显微检测，这4种组合条件下均可检测到Nrf2-Keap1在细胞中的相互作用；所述的Nrf2和Keap1为完整的氨基酸序列，所述eGFP的N158为对应氨基酸残基自N末端第1-159位氨基酸；所述eGFP的C159为对应氨基酸残基自N末端第159-265位氨基酸，所述的linker的长度为5个氨基酸RSIAT；

所述Nrf2蛋白的DNA序列如SEQ ID NO：1所示；

所述Keap1蛋白的DNA序列如SEQ ID NO：2所示；

所述Keap1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示

所述eGFP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；

所述RSIAT Linker蛋白的DNA序列如SEQ ID NO：6所示。

2.如权利要求1所述的一种指示Nrf2-Keap1相互作用的BiFC细胞内检测系统，其特征在于，所述的重组而成的载体由表达载体pEGFP-C1删掉编码eGFP的编码片段pC1和编码A、B、C、D的基因片断重组而成。

3.如权利要求1所述的一种指示Nrf2-Keap1相互作用的BiFC细胞内检测系统，其特征在于，所述表达融合蛋白A的重组载体为将所述编码融合蛋白A的DNA分子插入表达载体pC1得到的载体。

4.如权利要求1所述的一种指示Nrf2-Keap1相互作用的BiFC细胞内检测系统，其特征在于，所述表达融合蛋白B的重组载体为将所述编码融合蛋白B的DNA分子插入表达载体pC1得到的载体。

5.如权利要求1所述的一种指示Nrf2-Keap1相互作用的BiFC细胞内检测系统，其特征在于，所述表达融合蛋白C的重组载体为将所述编码融合蛋白C的DNA分子插入表达载体pC1得到的载体。

6.如权利要求1所述的一种指示Nrf2-Keap1相互作用的BiFC细胞内检测系统，其特征在于，所述表达融合蛋白D的重组载体为将所述编码融合蛋白D的DNA分子插入表达载体pC1得到的载体。

7.如权利要求1所述的一种指示Nrf2-Keap1相互作用的BiFC细胞内检测系统，其特征在于，所述表达载体pC1为pEGFP-C1删掉编码eGFP的DNA片段，其DNA序列如SEQ ID NO：7所示。

8.一种指示Nrf2-Keap1相互作用的BiFC细胞内方法，其特征在于，将权利要求1所述的融合蛋白组AC、AD、BC、BD的重组载体任意一种组合共同导入宿主细胞，得到转基因细胞，观察转基因细胞，若有荧光产生，表明Nrf2-Keap1存在相互作用，若外界刺激或药物处理，荧光信号强度发生变化，表明Nrf2-Keap1和相互作用受到抑制或增强。