[发明专利]一种指示Nrf2‑Keap1相互作用的BiFC细胞内检测方法及系统

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种指示Nrf2-Keap1相互作用的BiFC细胞内检测方法及系统。

背景技术

化学药物治疗是肿瘤治疗技术的常规疗法，但化疗耐药性仍是目前肿瘤临床治疗的难点，会导致肿瘤复发、转移，严重影响患者生存质量。Nuclear factor erythroid 2-related factor(Nrf2)可调控抗氧化反应，抵抗由活性氧和亲电试剂造成的细胞损伤。Kelch-like ECH associated protein 1(Keap1)，是依赖于(Cullin-3)的E3连接酶复合物的特异性底物衔接蛋白，负调控Nrf2的活性。肿瘤细胞Keap1-Nrf2通路常处于过度激活状态，Nrf2表达上调，以抵抗胞内高水平的ROS和化疗药物的攻击，但是肿瘤细胞产生耐药性的机理十分复杂，Keap1与Nrf2的调控作用模型还存在争议，肿瘤细胞耐药性与Keap1/Nrf2通路的分子调控机理还有待于进一步研究。

人体细胞电子失衡与多种疾病发生相关，如果体内活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平升高，就会使得氧化还原状态失衡。Nrf2与Keap1及其下游靶基因的抗氧化反应元件ARE共同构成的Nrf2-Keap1-ARE信号通路是细胞氧化应激反应中的关键通路。

在正常生理状态下，Keap1通过将Nrf2锚定在细胞质中并介导Nrf2的泛素化降解抑制Nrf2活性。Keap1利用C端的DGR结构域与Nrf2 N端的Neh2结构域(包括DLG和ETGE序列)相互作用结合成二聚体，并与胞浆肌动蛋白结合将Nrf2锚定在胞浆中，其N端的BTB结构域是滞蛋白(cullin)依赖性泛素连接酶E3的作用底物，促进Nrf2泛素结合和随后的26S蛋白酶体降解，使Nrf2的含量维持在基础水平介导相关基因的基本转录。当细胞内氧化物或自由基增多时，或细胞暴露于亲电物质时，Keap1同二聚体的Kelch结构域可与Nrf2的Neh2结构域N端的DLG模体和ETGE模体结合。Keap1与DLG的结合是弱结合(门闩)，与ETGE的结合是强结合(铰链)，铰链的强度是门闩的100倍。当发生氧化应激时，Keap1的半胱氨酸残基被修饰，Keap1构象发生改变，破坏了Kelch与DLG的弱结合(门闩破坏)，但是Kelch与ETGE的强结合不受影响(铰链保留)。此时，Nrf2依然与Keap1结合，但是门闩连接的破坏足够阻止Nrf2的泛素化，结果导致Keap1被Nrf2饱和，新生成的Nrf2发生磷酸化，不断地自胞质进入胞核，与小分子蛋白Maf(如MafG、MafT、MafF、Mafk(运晨霞等，2008))、Jun、ATF(activating transcription factor)(Yu et al.，2011)、Bach1(王梅芳等，2009)等结合形成异二聚体，识别ARE上的DNA序列并与之结合，激活ARE调节的靶基因启动II相解毒酶和抗氧化应激蛋白基因(醌氧化还原酶(nicotinamide quinone oxidoreductase 1，NQO1)、谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferase，GSTs))的转录，编码抗氧化蛋白，提高细胞抗氧化应激能力。

因此，通过构建Nrf2-Keap1相互作用的胞内可视化检测系统，可以通过对荧光的检测分析影响Nrf2-Keap1相互作用的药物，实现对细胞中的Nrf2-Keap1的实时监控。当正常细胞受到外界刺激时，胞内Nrf2水平升高，活化的Nrf2通过调控下游靶基因发挥防御保护细胞的作用。但对于肿瘤细胞，Nrf2水平升高却导致其对化疗药物的敏感性降低，即出现肿瘤耐药(Kansanen et al.，2013)。

蛋白质相互作用研究是蛋白质功能和信号调控研究的重要内容，荧光蛋白作为可视化的蛋白标记在细胞研究中应用越来越广泛。近年来发展的双分子荧光互补技术(BiFC)被广泛应用于体内蛋白质的研究。蛋白Nrf2和其胞质接头蛋白Keap1是肿瘤细胞耐药性分子机制中的重要调节者。因此，灵敏的Keap1和Nrf2相互作用检测系统一直是筛选药物的需要。BiFC技术操作简单，结果直观，可在活细胞的生理状态下直接观察到细胞内蛋白互作。荧光蛋白经过改造，发展了多个适合BiFC的荧光蛋白。