[发明专利]一种疫苗组合物及其制备方法

权利要求书

1.一种疫苗组合物，其特征在于，包括禽流感病毒H9亚型抗原、禽腺病毒4型抗原、禽呼肠孤2型病毒抗原和禽白血病J型抗原以及佐剂；

所述疫苗组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.细胞制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含5％～10％v/v新生牛血清和1.0％～1.2％v/v双抗的DMEM培养液在37℃、5％CO₂培养至细胞单层后，再用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型和禽呼肠孤2型病毒接种；将DF-1细胞用胰酶消化分散，用含5～10％v/v新生牛血清和0.8％～1.0％v/v双抗的DMEM/F12培养液在37℃、5％CO₂培养至细胞单层后，再用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于禽白血病病毒J型接种；

S2.病毒的接种和培养：分别将禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型和禽呼肠孤病毒2型毒种按终体积1:50～1:500接种到步骤S1制备的LMH细胞；将禽白血病病毒J型毒种按终体积1:50～1:500接种到步骤S1制备的DF-1细胞，并在37℃吸附30～60分钟后吸弃病毒液，再用细胞维持液于37℃、5％CO₂培养120小时，得细胞培养液；

S3.病毒收集、浓缩和纯化：将步骤S2得到的病变的细胞培养液冻融2～3次，于4℃、5000rpm的条件下离心8～12min，分别收集禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型上清液，接着进行TCID₅₀和EID₅₀检测，合格后，将上述上清液分别超滤浓缩，得禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型病毒液；

S4.病毒灭活：采用0.05～0.2％福尔马林灭活上述步骤S3得到的禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型制苗病毒液，即为疫苗抗原；

S5.疫苗组合物配制，即得；

所述步骤S2中细胞维持液包含DMEM/F12培养液93～95％，新生牛血清2～4％，右旋糖苷0.5％～2％，甘油1～2％和双抗0.8～1.0％；

所述步骤S5疫苗的配制方法，包括以下步骤：

I.油相制备：按以下重量份称取各物质：优质注射用白油90～92份，卵磷脂1～5份，硬脂酸铝1～3份，司盘-80 2～6份；先将白油缓慢加温至75～85℃，待完全溶解后依次加入卵磷脂、司盘-80和硬脂酸铝，搅拌至均匀；

II.水相制备：将灭活后的禽流感病毒H9亚型抗原、灭活后禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型按体积比1:1:1:1混合均匀得抗原混合液，向抗原混合液中加入灭菌后的吐温-80、巴戟天多糖和丙氨酸，搅拌至均匀；

III.乳化：按油相:水相＝2:1的体积比，先将油相倒入乳化罐，搅拌转速为10000～15000rpm，温度10～20℃的情况下，将水相以0.2～0.8mL/s的速度加入油相中，再继续以速度13500～17500rpm乳化3～7min，即得。

2.根据权利要求1所述疫苗组合物，其特征在于，所述禽流感病毒H9亚型抗原、禽腺病毒4型抗原、禽呼肠孤2型病毒抗原和禽白血病J型抗原均为灭活全病毒抗原。

3.根据权利要求1所述疫苗组合物，其特征在于，所述油相中各物质及其重量份为：优质注射用白油91份，卵磷脂3份，硬脂酸铝2份，司盘-80 4份。

4.根据权利要求1所述疫苗组合物，其特征在于，所述水相中各物质重量份为：抗原混合液85～90份、吐温-80 2～6份、巴戟天多糖3～7份和丙氨酸1～5份。

5.根据权利要求1所述疫苗组合物，其特征在于，所述水相中各物质重量份为：抗原混合液88份、吐温-80 4份、巴戟天多糖5份和丙氨酸3份。